首先，作者通过两个单糖用模块化方法合成了二糖骨架。作者在化合物1（供体）上使用了一个武装的TBS基团，在化合物2（受体）上使用了一个去武装的氯乙酰基（ClAc）基团，优化条件后实现了克级的、产率达85%的模块化二糖合成（化合物4）。此外，作者还测试了预装有乳酸基的化合物3是否能参与模块化二糖合成，但可能由于反应立体结构的阻碍，由化合物1、3合成化合物5的产率仅达到了39%。据此，作者之后仍采用化合物4进行后续的合成工作。

随后，作者对二糖骨架上NAM和NAG进行N取代修饰。对NAM骨架进行N取代基团的转化途径为：化合物4通过氯乙酰基酯的连续水解、选择性的N-Troc脱保护和原位N-乙酰化，以69%产率得到化合物6，化合物6随后除去邻苯二甲酰亚胺，连接乙二醇和乙酰基，分别得到化合物8（72%）和化合物9（69%）。对NAG骨架进行N取代基团的转化途径为：在NaBH4还原条件下，化合物4的氯乙酰酯和邻苯二甲酰亚胺同时被脱保护，然后进行乙酰化处理，得到带有Troc基团的化合物7，产率为89%；随后，使用Zn/AcOH在单电子还原条件下除去7上的Troc基团，然后与单个苄基乙二醇、Boc和乙酰基共轭，分别得到化合物10（65%）、化合物11（62%）和化合物12（66%）

接着，作者尝试在N取代后的二糖骨架的NAM的C-3位置安装肽链。作者经过尝试，在TBS脱保护之前用甲基酯基对5个中间体的酸基进行了预保护，并以56%至61%的产率得到了对应的醇（化合物13-17）。随后，在碱的作用下水解化合物13-17，然后在HATU的作用下偶联H-L-Ala-D-isoGln(OBn)，以产率61-77%得到化合物18-22。最后，对化合物22，在氢化之前进行了NBS介导的STol脱保护，再通过氢化去除化合物22上的苄基醚，最终以72%的产率得到化合物27。作者使用相同的转化方法，获得了N-取代的GMDP 化合物（23-26），最终产率为58-67%。

最后，作者使用六种合成的N取代GMDP（化合物23-27）测试其激活人源NOD2响应的能力。作者使用HEK-Blue NOD2依赖性NF-κB诱导试验来评估的N取代GMDP对人源NOD2刺激的能力，并以N-乙酰胞壁酰二肽（MDP）作为参考化合物，如果N取代GMDP可刺激人源NOD2，便可激活NF-κB通路，从而诱导SEAP的产生，SEAP分解培养基内的颜色底物后会使培养基变蓝，从而可以通过分光光度计测得吸光度得到不同N取代GMDP对人源NOD2刺激能力的差别。

结果显示，含两个NAc分子的GMDP 27在10μM时的活性与MDP相似，含有MurNGc分子的化合物23的活性比GMDP 27弱，而含有GlcNGc分子的化合物25的活性比27和23都弱。综上，NAM或NAG上的N-糖基修饰都可以损害NOD2的刺激活性，该修饰对NOD2刺激活性的减弱作用可能是细菌病原体逃避宿主先天免疫反应的机制之一。在MurN上带有游离胺的GMDP 24对NOD2刺激效果较弱，在MurN上带有分子内酰胺基的GMDP 28对NOD2刺激效果也较弱；相反，在GlcN上带有游离胺基的GMDP 26仍有刺激NOD的活性。这表明胞壁酸的结构变化和二肽的缺失影响了配体-受体的识别。

从上述结果可以得出，细菌病原体比N-乙酰葡糖胺（GlcNAc)更易对N-乙酰胞壁酸(MurNAc)进行结构修饰，使其成为游离胺糖形式，以减弱PGN对人源NOD2的刺激，从而逃避宿主先天免疫系统和宿主防御反应。同时，科学家可以利用GMDP 26的GlcN上的游离胺基修饰不损害其对NOD2的刺激活性这一特性，在该位置安装一个标签或荧光基团作为化学探针，在保持其对NOD2的刺激活性下用于进一步的化学生物学研究。

综上，作者开发了一种合成不同的N-取代的GMDPs的模块化方法，通过一个正交的N-保护的二糖硫糖苷，合成了多种在NAM或NAG处含有游离氨基、N-乙酰基或N-糖基的GMDPs，并通过对比不同位置、不同取代基的N取代GMDPs对人源NOD2的刺激效果，得出细菌逃避宿主天然免疫系统的可能机制，并为研发保留对人源NOD2的刺激效果的GMDPs探针提供了指导。

原文引用：10.1002/asia.202101169

责任编辑：LD