今天跟大家分享一篇今年2月份发表在ChemicalScience 上的文章，题目是Cleavable and tunable cysteine-specifific arylation modifificationwith aryl thioethers。DOI: 10.1039/d0sc06576e。该文的通讯作者是中山大学熊小峰教授，他的主要研究领域是药物化学；多肽和蛋白质的化学修饰；有机合成化学。

肽/蛋白修饰是揭示其结构和功能、研究蛋白-蛋白相互作用、监测细胞生物学过程和开发治疗药物的重要途径。而在组成蛋白质的多种氨基酸中，半胱氨酸是翻译后修饰的一个有吸引力的靶点，因为其高亲核性和较低的天然丰度(1.9%)，并且可以通过定点诱变很容易被结合到特定的位点。为了实现半胱氨酸特异性修饰，人们在开发高效选择性修饰试剂方面进行了大量的努力，包括溴化马来酰亚胺、高价碘化合物、炔烃、烯烃等。近年来，基于SNAr的多种芳基化试剂被开发出来，并显示出良好的标记多肽的效率，包括芳基卤化物、杂芳基甲基砜和二甲基亚砜试剂等。然而，上述方法主要集中在提高修饰效率或优化cys -生物偶联键的稳定性。而在抗体药物偶联物和表观遗传修饰等领域有广泛应用的可断裂和可调控的cys -选择性修饰研究较少。因此开发一种高效、生物相容性和可再生可调控的半胱氨酸特异性修饰策略仍然是迫切需要的。

在本文中，作者报道了一种具有半胱氨酸选择性、无过渡金属、可再生可调控的芳基硫醚修饰肽/蛋白的方法（图1），该方法具有良好的化学选择性和反应活性，可用于肽的二次修饰。

图1. 通过SNAr机制可断裂和可调控的半胱氨酸芳基化策略

作者首先用一系列芳基化试剂测试模型肽1a的反应性。商品化的6-氯嘌呤2aa可与硫醇发生反应，具有良好的骨架功能化可行性。然而，反应没有发生，这可能是由于氯原子离去能力不可行。作者受到Nat. Chem., 2018, 10, 1023-1030.文中提到SNAr的动态和自校正特性的启发，用一系列芳香族硫化物取代氯原子，研究了它们与肽1a的反应性。并通过调整反应的当量、反应浓度和DMSO的比例来提高修饰效率。最后确定了最佳反应条件为室温下，肽浓度为1 mM, 3当量芳基化试剂在100 mM Tris缓冲液(pH 8.0, 1% v/v DMSO)中进行反应（图2）。

图2. 半胱氨酸芳基化反应条件的优化

在确定最佳反应条件后，作者开始筛选芳基化底物。发现具有不同杂环骨架的苯并恶唑硫化物，包括嘌呤、嘧啶、喹唑啉、三唑嘧啶和吡唑嘧啶，均能顺利地得到所需的修饰产物。考虑到反应效率、合成可行性和官能团相容性，作者选择了嘌呤和吡唑嘧啶基苯并恶唑硫化物骨架，进一步丰富了芳基化底物的种类。以嘌呤为骨架的具有不同官能团的苯并恶唑硫化物能有效地修饰肽1a并获得良好的收率。当用吡唑嘧啶取代嘌呤骨架时，芳基化过程进行得更有效。此外，使用带有炔、叠氮、聚乙二醇(PEG)聚合物和亲和标记等生物相关基团或携带氨基酸片段、药物分子或荧光标记的芳基化试剂也可得到相应的产物。这表明该方法在支链肽合成、抗体-药物偶联物和生理学研究等方面具有潜在应用。

由于带有吡唑嘧啶骨架的苯并恶唑硫化物具有令人满意的反应效率和功能化可行性，作者选择2i进一步研究可修饰的含半胱氨酸的多肽的范围（图3）。作者首先考察了含不同氨基酸的四肽。结果都获得了所需产物。接着考察了苯并恶唑硫化物对长肽的修饰活性。六肽、八肽和14肽均可顺利反应，以优良的产量提供所需的半胱氨酸修饰产物。当用丙氨酸替换八肽中半胱氨酸时不与2i反应，未得到芳基化产物，进一步证明了芳基硫醚化合物对半胱氨酸优良的化学选择性。

图3. 可修饰的含半胱氨酸的多肽范围筛选

接着作者对修饰后的肽对酸、碱、氧化剂和外部硫醇的稳定性进行了测试。结果显示，带有吡唑嘧啶骨架的修饰肽可能会受到外部硫醇攻击并恢复到其天然未修饰状态，而基于嘌呤骨架的修饰肽不可以。作者猜测可以通过简单地调整芳基硫醚的骨架结构来进行修饰后再生肽/蛋白质的可能性。

为了自己验证的猜测：作者使用模型肽1a与不同的芳基化试剂反应，接着添加外部硫醇巯基乙醇(βME)或谷胱甘肽(GSH)。结果表明，具有不同芳基骨架的修饰肽具有不同的再生活性。基于嘌呤骨架的产物在βME或GSH 中相对稳定，而基于喹唑啉、三唑嘧啶和吡唑嘧啶骨架的修饰肽容易被βME攻击并恢复到未修饰状态。这些结果清楚地表明，通过简单地调整新开发的芳基硫醚的骨架和空间位阻，可以实现可断裂、可调节和cys特异性的肽修饰。为了证明可断裂和可调控的Cys修饰方法的普遍性，作者选择了具有不同再生能力修饰肽的2ad和2i，然后将βME添加到反应混合物中，通过LC-MS进行分析。结果表明，经2i修饰的四肽、八肽、14肽均能被βME有效攻击，并在1小时内恢复到未修饰状态，收率超过90%，而2ad修饰的肽再生能力较弱，收率小于14%（图4）。

图4. 2i和2ad再生肽的LC-MS产率

蛋白质修饰对于研究它们的结构和功能至关重要。为了探讨蛋白质修饰方法的可行性，作者测试了所开发的吡唑嘧啶硫化物对牛血清白蛋白(BSA)的反应性。将带亲和标记的吡唑嘧啶硫化物 2v与牛血清白蛋白孵育，在微改性反应条件下得到了效果良好的修饰产物(图5)。此外，通过叠氮-炔点击反应得到了芳基硫醚修饰的荧光产物，表明该方法在生物化学方面具有潜在的应用前景。

图5. 吡唑嘧啶硫化物2v修饰BSA

总之，作者通过SNAr方法开发了一类具有良好化学选择性和效率的芳基硫醚化合物来修饰含半胱氨酸的肽/蛋白。这种修饰策略在优化的反应条件下具有广泛的底物范围和官能团相容性。多种生物相关基团可以很好地引入修饰物中。通过简单地调整芳基硫醚的骨架，可实现肽/蛋白的可断裂和可再生的修饰。此外，还实现了修饰肽的二次标记，表明了本方法在肽领域的广泛应用。