ChemBioChem：基于高通量质谱和体内/体外酶催化性能关联的蛋白质工程

三乙酸内酯（TAL）是生物工程的重要产品（图1A），它是诸多商业化学品和药物的关键前体。在代谢工程领域，TAL的产量已经获得很大提升，但催化TAL生成的关键酶2-吡喃酮合酶（2PS，图1B）对底物丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）的催化效率仅有大约10² M^-1s^-1，远低于其他次生代谢酶的平均性能。以往文献报道中也有通过蛋白质工程改造2PS的工作，但仍缺乏系统性，活性位点周围还有很大改进空间。定向进化是较好的研究方案，但缺乏高效的方法对大量改造菌株的产量进行精准检测。

图1: A) TAL及其转化物的应用-蓝色标记的分子可用作食品添加剂、芳香剂等，红色标记的分子可用作基础合成原料；B) 2PS晶体结构；C) 成像质谱高通量定量流程

为进一步优化2PS效能，德克萨斯大学奥斯汀分校Lu Yi教授团队与伊利诺伊大学香槟分校Jonathan V. Sweedler教授合作，在之前对2PS蛋白质工程的研究基础上 (Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.202212440)，基于体内/体外酶催化活性关联对2PS进行了系统性的蛋白质工程改造，并采用高通量成像质谱方法（图1C，Anal. Chem., DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04845）对TAL的产量进行快速定量（1分钟/样品）。

通过多轮定向进化，团队成功获得优质2PS改造酶。其中L202G/G205S/M259L/L261C-2PS在大肠杆菌中的TAL产量比野生型高46倍、比报道过的最佳2PS突变型（L202G/L261N-2PS）高2.5倍；另一突变型L202G/L261C-2PS的催化效率(k_cat)比野生型高44倍，比L202G/L261N-2PS高1.5倍（图2A）。

通过测定米氏常数，作者发现L202G/L261C-2PS的催化效率虽然最高，但对底物malonyl-CoA的亲和力低。相比于L202G/G205S/M259L/L261C-2PS，它的低产量表明了酶和底物亲和力对代谢反应的影响。作者利用合成生物学转化了一条额外的代谢途径，使大肠杆菌能够通过丙二酸生成更多的malonyl-CoA。作者惊奇地发现，当malonyl-CoA浓度提高约三倍时，最优产量的突变型从L202G/G205S/M259L/L261C-2PS变成了拥有更快反应速率的L202G/L261C-2PS。这一现象显著地展现了体内/体外的蛋白质工程的差异，并且强调了正确的选择压力的重要性。值得注意的是，这种细胞内的选择压力通常很难通过体外实验环境去模拟，因为像malonyl-CoA这样的中心代谢物在体内会持续生成、高度调控并且维持在特定的浓度。

图2：A）关键变种的产量对比；B）关键突变型的米式方程，MatB/C途径用于合成malonyl-CoA。

本文作者将蛋白工程与高通量筛选相结合，系统性地研究分析了体内/体外酶催化性能的差异，并获得了两个2PS的高效突变体，表现出44倍以上的k_cat、25倍以上的催化效率和46倍以上的TAL产量。这一工作流程可以应用于其他天然产物的蛋白质工程和合成生物学的研究。

论文信息

Enhancing 2-Pyrone Synthase Efficiency by High-Throughput Mass-Spectrometric Quantification and In Vitro/In Vivo Catalytic Performance Correlation

Yu Zhou, Shuaizhen Zhou, Scott Lyons, Haoran Sun, Prof. Jonathan V. Sweedler, Prof. Yi Lu

ChemBioChem

DOI: 10.1002/cbic.202300849