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ChemBioChem:通过salt-toggled capture selection筛选结合尿酸的DNA适配体2023-02-28
尿酸(2,6,8-trihydroxypurine, UA)是人类嘌呤代谢的最终产物。人体中尿酸含量是一系列疾病的重要指标,包括痛风,肾脏疾病以及高血压。由于尿酸含量具有重要的临床意义,精确且灵敏的检测方法极其重要。目前,高效液相色谱-质谱法可以准确检测尿酸。基于酶的方法也有发展,但是大多数需要将尿酸转化,通过检测反应过程中的副产物 (例如,双氧水),进而简介检测尿酸。因为这类方法需要多步骤,所以直接且简便的尿酸检测方法至关重要。

核酸适配体是用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)经过多轮筛选后得到的单链DNA或RNA, 可以和多种目标物高特异性结合。由于 DNA适配体的高稳定性,可编程性以及易于与多种信号报告物质结合等优点,在生物传感器领域应用广泛。此前,加拿大滑铁卢大学化学系的刘珏文课题组筛选得到UA-Na-1 (图1b) DNA 适配体, 对尿酸的结合有着高结合系数(Kd ~ 1 µM)和特异性。但是,UA-Na-1的结合需要很高的钠离子浓度(饱和在700 mM 氯化钠),因此在体液条件下结合不好。近日,该课题组通过轮流用含有钠离子或锂离子的筛选缓冲液(两个溶液里都含有镁离子)的Salt-toggled SELEX方法 (图1c),筛选出了需要低浓度镁离子结合尿酸的DNA适配体 (UA-Mg-1)(图1a)。

跟之前得到的UA-Na-1相比,UA-Mg-1 有相似的折叠二级结构,但不一样的环状部分的序列 (图1a和b橙色部分)。等温滴定量热法(ITC)显示,在两个筛选缓冲液里UA-Mg-1适配体均与尿酸结合 (图1d和e),并且有相近的Kd (7-8 µM)。去掉溶液中的钠离子不影响适配体与尿酸的结合(图1f),但是去掉镁离子完全没有结合 (图1g)。进一步说明了结合依赖于镁离子而不是钠离子。

 

 

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图1. (a-b)UA-Mg-1 和 UA-Na-1的结构。(c)筛选示意图。(d-f)尿酸与适配体的ITC,分别在钠离子筛选缓冲液,锂离子筛选缓冲液,去掉钠离子的筛选缓冲液和去掉镁离子的筛选缓冲液中。

接下来,作者利用这个DNA序列,通过适配体结构转换和链置换方法建立了荧光传感器。当溶液中的传感器浓度和尿酸浓度一定,溶液中的镁离子浓度增加,背景值下降 (图2a和b),说明镁离子有助于产生较高的信背比。滴定实验显示UA-Mg-1对尿酸的结合只需要一个镁离子 (图2c和d),这与之前筛选的UA-NA-1适配体需要三个钠形成对比 (图2e)。在筛选溶液中检测尿酸分子得到与ITC实验非常相似的结合常数 8.9 µM。在此条件下,传感器检测限是0.5 µM尿酸。

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图2. (a-b)溶液中不同镁离子浓度的动力学和拟合曲线。(c-d)不同尿酸浓度的动力学和拟合曲线。(e)UA-Mg-1和UA-Na-1结合尿酸的示意图。

该工作通过改变筛选过程中的离子类别,得到需要不同金属离子的尿酸DNA适配体,为直接快捷检测尿酸提供了新试剂。

文信息

Salt-Toggled Capture Selection of Uric Acid Binding Aptamers

Yibo Liu, Juewen Liu

ChemBioChem

DOI: 10.1002/cbic.202200564

 

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