在J. Am. Chem. Soc.上报道的一篇标题为 “Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O-Linked β-N-Acetylglucosamine Strategy” 的文章。该文的通讯作者是来自北大-清华生命科学中心、清华大学化学系的刘磊教授。刘磊课题组的核心研究方向是蛋白质的化学合成，致力于解决蛋白质化学合成中的各种问题，并服务与生命科学研究。

富含二硫键的蛋白质，包括胰岛素、细胞因子信号分子白细胞介素 2 (Interleukin-2, IL-2)等，在生物医学、结构和药物研究中发挥重要作用并且被广泛使用。然而，这类蛋白质正确的化学合成却始终是个难题。许多化学合成方法如固相肽合成和肽连接等策略能够改善一些富含二硫键蛋白的合成效率，并极大地加快它们的生物医学研究。但一些蛋白质，例如全身性铁稳态调节激素铁调素，由于体外折叠效率差，仍然难以合成。其他，如白细胞介素 5 (IL-5)，则根本不能在体外折叠。

细胞中天然具有辅助蛋白质形成二硫键和折叠的策略。组装在核糖体中的新生肽被转移到内质网和高尔基体，并被糖基转移酶修饰以在 Ser 和 Thr 等残基处携带糖基化修饰。这些糖基化修饰被认为通过增加折叠中间体的稳定性来促进正确折叠。受到这一机制的启发，刘磊课题组报道了一种操作简单且经济的可移动糖基化修饰策略(removable glycosylation modification, RGM)，可用于合成具有多个二硫键甚至链间二硫键的正确折叠蛋白质。（图1）

图1. RGM辅助的蛋白质折叠策略：化学合成正确折叠的富二硫键蛋白质

作者团队从研究铁调素的化学合成开始，它包含4对二硫键，在维持铁稳态中起着关键作用。铁调素及其衍生物已被深入研究用于诊断和治疗与铁调节激素失衡相关的疾病，如血色素沉着症。然而，铁调素的直接氧化折叠必须通过使用四对正交的Cys保护基团逐步形成二硫键，这是效率极低的。作者分别固相合成了Ser17位修饰GlcNAc的肽段1以及不含糖基化修饰的铁调素2作为对照组，用HPLC和MS进行表征（图2A-C）。他们在合适条件下测试了1和2的折叠。通过HPLC证明1能够快速生成新的化合物峰3，并且3 的 ESI-MS 分析表明它的分子量为 2991.77 Da，比 1 小 8.0 Da，表明1折叠为3，同时游离 -SH 基团形成四个二硫键（图2B）。相比之下，在相同条件下，2 小时后 2 完全转化为 2’（图2D）； 2′ (2793.68 Da) 的分子量仅比 2 小 2.0 Da，表明形成了仅包含一个额外二硫键的折叠中间体。他们同时验证了GlcNAc可以被糖苷酶快速除去，因此可以通过两步完成肽1到产物4的折叠和去糖基化，总分离收率为31%，远高于之前工作的数据。除了Ser17外，该团队还注意到其他两个残基(Thr2和Thr25)也可以被类似的修饰，并通过相似实验确定了这种修饰辅助折叠的可行性。（图2F-I）他们还分析了其¹H−¹H同核核磁共振谱(DQF-COSY，TOCSY以及NOESY)和¹H−¹³C HSQC谱，通过NOE现象确定了折叠后蛋白的结构（图2E）。

图2.基于RGM的铁调素4化学合成路线及验证

受到这个结论的鼓舞，该团队又继续研究了分子量更大，难度更高的白细胞介素5(Interleukin-5, IL-5)的化学合成及糖基化辅助折叠。他们将 IL-5 的单体 9 分为三个部分：IL-5(1−43, T₁₄^O-GlcNAc, T₂₃^O-GlcNAc)−NHNH₂(11), IL-5(44−85, T₅₄^O-GlcNAc, S₇₃^O-GlcNAc)-NHNH² (12) 和 IL-5h(86-115) (13)，对它们分别进行O-GlcNAc修饰，再用NCL天然化学连接将它们相连。这四个残基都位于IL-5的溶剂暴露表面；因此，它们的修饰有望避免RGM基团对所需的蛋白质结构的干扰（图3A, B）。将这些片段用于糖基化辅助的折叠实验，RP-HPLC 分析显示15仅转化为一个主要峰 (16)，观察到的分子量为 27920.89 Da。ESI-MS 分析，对应于9的同二聚体（计算质量：27920.12 Da），而无糖基化辅助的单体9’则不能形成同源二聚体（图3C, D, G, H）。

图3. 基于RGM 策略的同型二聚体 IL-5的化学合成及验证

理论上，折叠二聚体16可能有两种可能的结构异构体(I和II)，具有不同的二硫键模式(Cys44−Cys86’，Cys86−Cys44’)或(Cys44−Cys44’，Cys86−Cys86’)（图4A, B）。于是作者团队试图鉴定在糖基化辅助的折叠二聚体中二硫键的形成模式。胰蛋白酶消化和串联质谱/质谱实验证实，16具有Cys44−Cys86’和Cys44’−Cys86的链间二硫键（图4B,C）。OGA糖苷酶的消化实验以及后续的鉴定也证明能够在去除糖基化修饰的同时维持二聚体的链间二硫键结构（图4D）。合成 IL-5 (10) 的圆二色(CD) 光谱在 208 和 222 nm 处显示出特征性负吸收，与商业化重组 IL-5 的测量结果一致（图3F）。表面等离子共振测定(SPR)被用于检验 IL-5 (10) 与 Reslizumab 的结合，Reslizumab 是一种针对 IL-5 的人源化抗体。测得的合成 IL-5 (10) 与 Reslizumab 的结合亲和力K_d为 6.03 pM，与商业重组 IL-5 (5.42 pM)的结合力值一致（图 3G, H）。这些数据都表明，通过糖基化辅助折叠合成的IL-5并没有出现性质的缺失和差别。

图4. 化学合成的同源二聚体IL-5中二硫键位置的表征以及化学合成的IL-5的性质验证

综上所述，该团队发现，在丝氨酸/苏氨酸位点引入简单的GlcNAc(RGM)基团可以有效地改善富含二硫键的蛋白质的折叠。RGM基团可以通过固相肽合成和肽连接添加，如Fmoc-L-Ser/Thr(β-c-D-GlcNAc(Ac)₃)-OH。在RGM辅助折叠后，OGA可以将RGM基团完全清除，以获得具有多个二硫键的正确折叠的蛋白质。这是一种实用、操作简单、成本效益高的合成含多二硫键蛋白的技术，在生命科学、药学、医学等领域中有广泛的应用前景。

作者：DYH    审校：WS

DOI: 10.1021/jacs.1c10091

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c10091