引言

酶的定向进化开发出了多种用于合成有机化学的生物催化剂的可行途径，大大降低了生物催化在工业化应用上的成本，因此获得了2018年的诺贝尔化学奖。随着定向进化的不断发展，自然界的化学成分不断增加，产生了越来越复杂的小分子，对高通量和通用化筛选工具的需求至关重要。常规的筛选工作主要依靠光学方法，这种方法通常具有明确的酶反应检测范围，因为它们通常在目标分子上需要合适的发色团或基于耦合副产物的检测。对于一些不容易离子化，不具有明显的生色团或不会产生荧光信号，并且无法与细胞的生存能力、可测量的副产物偶联或利用生物报告系统的酶反应底物，通常无法利用常规光学方法进行相应酶活性的筛选。

成果简介

 

近日，美国西北大学的Milan Mrksich教授作为通讯作者在《J.Am.Chem.Soc》上发表了题为“High Throughput Screeningwith SAMDI Mass Spectrometry for Directed Evolution”的文章。该文章提出了一种基于SAMDI质谱的高通量筛选策略，用于筛选酶变体库以提高其活性。该方法将未纯化的反应产物固定在自组装的单分子层上，并通过质谱分析，可在一小时内直接评估数千种酶变体。

图文解读

图1. SAMDI筛选测定法在定向进化循环中的用途。（A）在96孔板中表达细胞色素P411的突变体文库，并使其与底物（紫色）和重氮乙酸乙酯反应，形成相应酯产物（橙色）。（B）使用自组装单分子膜来选择性地固定细胞悬浮液中的底物和反应产物。基于反应产物的化学性质，文章选择对表面进行改造以在三（乙二醇）基团的背景下呈现马来酰亚胺基团。随后用酸处理反应产物以显示出硫醇，从而可以通过Michael加成反应将其固定在单分子层上（C）通过SAMDI MS分析该阵列，并且将结果显示为热图，橙色代表活性增加的酶，紫色代表相对于亲本样活性（白色）降低的酶。因此，只需要通过分析物-硫代烷烃共轭物质量的相应变化来鉴定产物，并对底物和产物的峰进行积分即可为反应提供产率。结果显示底物峰出现在1033 Da，相比之下的产物峰移动了+86 Da。

图2.通过GCMS和SAMDI从70个突变体文库中收集的筛选结果散点图，使用气相色谱质谱法（GCMS）对SAMDI进行了验证。将值计算为产物相对于剩余的起始原料和形成的产物的总数的分数。使用最小二乘线性回归确定相关性。

表1. SAMDI的通量和总筛选工作量与常规筛选方法的比较。在三轮演变过程中，研究人员通过SAMDI共获取了近5000个变体的数据，比GCMS预期的要快140倍。在这里，每轮数据生成仅需要几个小时，从而将总分析时间从24天减少到17小时。

图3.使用GCMS来表征hits并获得每个酶突变体的总转化数（TTN）。显示了C411烷基化的P411的进化谱系。条形代表平均产量（从两个独立的细胞培养物中进行，每个都用于重复反应）。反应条件如下：大肠杆菌全细胞中的细胞色素P411 （在600 nm处的光密度，OD600为1），5 mM底物，5 mM重氮乙酸乙酯，在M9-N缓冲液中在室温下于厌氧条件下的5 vol％EtOH条件18小时。星号表示终止密码子的引入。最终的突变体显示出相对于亲本酶活性2倍的改进，即约1300 TTN。

总结展望

在整个研究过程中，研究人员筛选了上千个突变体，生成并处理了22944个光谱。由于每块板每次运行仅需30分钟，因此SAMDI的数据收集速度比传统GCMS快100倍以上，比最新技术水平快10倍左右。SAMDI-MS已被广泛用于分析生化反应和复杂裂解物中的酶活性，同时每小时可分析多达数千个样品，每天可进行超过3万次实验。因此，这项研究中的筛选通量不受筛选的变体数量的限制。但是该方法不能应用于产物和底物具有相同质量的反应（包括立体异构和互变异构结构），并且在那种情况下将需要第二个反应步骤（对于一种分子是选择性的），即串联质谱，或分离步骤。

文献链接

https://doi.org/10.1021/jacs.0c07828

DOI:10.1021/jacs.0c07828

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