J. Am. Chem. Soc.┃超快速亲电半胱氨酸芳基化

分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.杂志发表题为Ultra-rapid Electrophilic Cysteine Arylation的研究论文，文章的通讯作者为美国罗德岛大学的Fang Wang教授。

快速的化学选择反应对于高效的化学合成至关重要，特别是在生物偶联化学中。这些转化通常需要在低浓度下将未受保护的生物大分子快速功能化，以提供高选择性的产物。生物偶联化学的一个主要挑战是确定在生物相容性条件下可以在微摩尔或更低浓度下有效进行的反应:环境温度下的中性水溶液。为了在1 h内达到97%的转化率，100 μM的化学计量共轭需要最小的二阶速率常数(k₂)为100 M^-1·s^-1。根据这一分析推断，1 μM目标底物的有效等摩尔标记需要更高的k₂ (10,000 M^-1·s^-1)的反应，在没有酶或其他催化剂的情况下很少能达到这个值。

图1. CAPs试剂结构及其与GSH在25 °C，pH 7.0的含100 mM KCl的50 mM PIPES缓冲液中的反应速率常数。

作者之前报道了一种与吡啶(CAP)盐(包括N -甲基-o-氟碘化吡啶(CAP1，图1B)及其衍生物)进行半胱氨酸芳基化的便捷方法。CAP1和谷胱甘肽(GSH)之间的反应在pH 7.0的25℃水溶液缓冲液中显示出高的二级速率常数，为116 100 M^-1·s^-1，因此可以在100 μM的浓度范围内有效地功能化半胱氨酸(图1C)。基于这些结果，我们推测更缺电子的吡啶盐将在温和条件下实现超快速半胱氨酸芳基化。因此，合成了两种水溶性吡啶盐，包括N -甲基-4-甲基磺酰基吡啶(CAP3)和N -甲基-2-甲基磺酰基吡啶(CAP4)四氟硼酸盐(图1B)。GSH的动力学研究表明，CAP3和CAP4在pH 7.0 PIPES缓冲液中25℃时的k₂值分别为9800和1200 M^-1·s^-1 (图1C)，具有显著的反应性。在pH 7.4的PBS条件下，CAP4与谷胱甘肽反应，反应速率为20000 M^-1·s^-1。这种极端的反应性使亚微摩尔半胱氨酸在几分钟内实现超快速芳基化。此外还合成了一种标记试剂N -甲基-2-氯-6-甲基磺酰基吡啶四氟硼酸盐(CAP5)，其离去基团为氯和甲基砜。反应性研究表明，CAP5还通过磺酰基取代与等摩尔谷胱甘肽发生超快速反应，反应速率约为320,000 M^-1·s^-1，在非常温和的条件下，无需任何催化剂，反应速度非常快(图1C)。

图2 多肽芳基化修饰。

对于含有其他亲核残基的结构复杂多，CAP3和CAP4也能以显著的化学选择性实现高效的半胱氨酸生物偶联。催产素，一种含有二硫键的九肽激素，可以被三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原。当催产素浓度降低100 μM时，2.1等量的吡啶盐在室温下（H 7.0 PIPES缓冲液中）标记两种半胱氨酸残基，在5分钟内以99%的转化率产生基本纯净的产物(图2C)。同样，含有二硫化物的14聚肽生长抑素也能在温和条件下与CAP3或CAP4快速反应，得到高转化率和高纯度的双芳基化产物(图2C)。CAP4与结构多样的底物(包括ADH-1和22-mer c型利钠肽)的反应也表现出接近定量的转化，强调了该化学反应的广泛范围。值得注意的是，正如HPLC和串联质谱(MS)研究证实的那样，CAP3和CAP4都完全芳化了所研究的所有肽的半胱氨酸侧链，突出了这些具有硫醇部分的吡啶亲电试剂比其他亲核试剂(包括赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸和未保护的n端)的明显偏好(图2C)。

图3. CAPs用于多肽大环化。

基于这些结果，利用基于cap的策略通过半胱氨酸钉接反应构建大环肽。两个亲电性不同且SNAr反应性相差5个数量级的碳原子的存在使得CAP5特别适合这种装订化学(图3)。在高底物稀释条件下，极具活性的砜取代碳可以引发超快速的分子间C – S键形成反应，这通常是生物大分子环化反应所必需的条件。相反，氯化碳的亲电性较低，不利于类似的分子间过程，以防止不希望的肽寡聚，但仍然允许可行的分子内半胱氨酸芳基化反应，只产生单体环化肽。催产素和生长抑素与CAP5的钉接反应实验支持了这种化学反应的高效率(图3B)。

图4. 基于砜的CAP试剂在蛋白质生物偶联中的应用。

接下来探索了两种原型含砜吡啶盐CAP3和CAP4与牛血清白蛋白(BSA)的反应。MALDI和完整蛋白质谱研究表明，这两种试剂在室温下，在pH 8.0 Tris或pH 7.0 PIPES条件下，均能在15分钟内有效地标记BSA，表明它们不仅对小肽，而且对大蛋白的硫醇基团具有非常高的反应性(图4A,B)。我们进一步研究了具有多个游离半胱氨酸残基的KRAS和耶尔森菌酪氨酸磷酸酶(YopH)蛋白的CAPs激活的芳基化。对CAP3芳基化KRAS的质谱分析显示，所有三种游离半胱氨酸都有效功能化。在YopH中，CAP3修饰了多达5种游离半胱氨酸，而在CAP 4标记的YopH中，MS数据显示只有3种半胱氨酸修饰。其余两个半胱氨酸残基(Cys93和Cys262)对应的标记信号接近检测极限，可能是由于这些位点的反应效率低下。使用双位CAP9试剂对蛋白质进行模块化的一锅两步功能化，该试剂具有邻氟和邻甲基砜作为离去基(图4C)。按照这一策略，我们在非常温和的条件下将CAP9与含酚的四甲基罗丹明(TAMRA)衍生物TAMRA-OH反应(图4C)。所得到的红色荧光吡啶盐CAP9-TAMRA在室温下原位生成，并在pH 7.0 PIPES缓冲液中促进了BSA和含半胱氨酸的绿色荧光蛋白(GFP V150C)的快速芳基化，证明了这种一锅两步化学的多功能性和高合成模块化(图4D,E)。

综上所述，本文提出的合成策略为在生物相容条件下超快速半胱氨酸功能化提供了一种简单且用户友好的解决方案。将阳离子吡啶系统与强吸电子的甲基砜部分配对，这种独特的化学反应极大地提高了半胱氨酸芳化的效率，在非常温和且没有催化剂的情况下，其速率常数高达870,000 M^-1·s^-1。值得注意的是，它们与半胱氨酸的高反应性并不会导致低化学选择性。CAP化合物与其他反应柄(如苯酚基序)的衍生化，有助于构建复杂的生物大分子支架，包括钉接肽和标记蛋白质，通常在几分钟甚至几秒钟内，纯度很高。基于CAP试剂的易获得性、方法的操作便捷性以及超快速和选择性转化，该合成平台有望在实际生物大分子修饰中得到广泛应用。