J. Am. Chem. Soc.：3-磷酸基荧光素：合成、光谱和应用

引言

自1871年首次合成荧光素以来，这种多功能分子一直是生物学、医学和化学生物学中应用最广泛的荧光团之一。荧光素和相关的氧杂蒽染料的广泛应用，部分是由于它们的高亮度和广泛的颜色范围，只需对氧杂蒽荧光团核心的末端和桥头原子进行简单的修改即可。荧光素末端氧原子被氮取代产生另一类氧杂蒽荧光团，即罗丹明。用碳、硅、磷、或硫取代荧光素10′氧原子可以红移激发和发射波长，避免了光毒性和自发荧光的相关问题，并提高了体内成像的组织穿透能力。相比之下，荧光素的3-羧酸盐的取代仍然没有得到充分的研究。3-取代基限制了内消旋环的自由旋转，提高了荧光量子产量。在荧光素3号位连上磺酸盐，不会螺环化，并改善了其水溶性，这些特性在基于荧光素的电压敏感型荧光团(VF染料)的设计中起到了重要作用。虽然3位磺酸基荧光素在荧光素报道13年后就有报道。但涉及生物相关的磷酸基团，3-磷酸基荧光素至今仍未有报道。作者探索这类未报道的3-膦荧光素所具有独特的性质。

成果简介

加州大学伯克利分校化学与分子细胞生物学助理教授Miller Evan在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为“Phosphonofluoresceins: Synthesis, Spectroscopy, and Applications”的研究论文。在这篇论文中，作者首次开发了3-磷酸基荧光素的合成路线，表征了这类新的氧杂蒽染料的光谱性质，并用3-磷酸基荧光素在细胞内成像和膜电位传感。3-磷酸基荧光素的双乙酰氧基甲酯很容易进入活细胞，表现出良好的积累和保留，与3-羧基荧光素相比，细胞亮度提高了近70倍。3-膦荧光素的游离酸形式不会穿过细胞膜，这使得它非常适合并入电压敏感支架。基于此，作者合成了电压敏感荧的荧光团，即phosVF2.1.Cl和Phosphono-VF2.1.Cl，具有优良的膜定位性、细胞亮度和电压敏感性，可与磺酸基VF染料相媲美。

图文解读

方案一，3-磷酸基荧光素的独特性质。3-磷酸基荧光素的吸收和发射相对母体3-羧基荧光素没有太大的改变。与3-羧基荧光素相比，3-磷酸基荧光素的水溶性更强，即使在低pH值和低介电介质中，3-羧基荧光素仍保持开环，可见光吸光状态，而3-羧基荧光素倾向于内酯化。3-磷酸基荧光素具有优良的膜定位性、细胞亮度和电压敏感性。

方案二，3-磷酸基荧光素的合成路线。在NiCl₂催化下，2-溴苯甲醛1以65%的收率合成芳基磷酸酯2。浓盐酸回流条件下水解为芳基磷酸3，使游离酸收率达到87%。3与间苯二酚在纯甲烷磺酸中缩合得到二卤代膦荧光素4和5。非卤化荧光素膦(6)也可以通过这条路线制备，但转化率较低，反应时间较长。

表一，荧光素类化合物的理化性质。pF.Cl(4)的溶解性几乎是2,7 -二氯-3-羧基荧光素的两倍，略低于sF.Cl。

图一，二氯荧光素对pH依赖性的光谱表征。(a) 3-羧基荧光素归一化吸光度谱图。(b) 3-羧基荧光素的归一化的吸光度随pH变化的滴定曲线。(c) 3-羧基荧光素的pH平衡以及pK_a。 (d) 3-磺酸基荧光素归一化吸光度谱图。(e) 3-磺酸基荧光素的归一化的吸光度随pH变化图谱。(f) 3-磺酸基荧光素的pH平衡以及pK_a。(g) 3-磷酸基荧光素归一化吸光度谱图。(h) 3-磷酸基荧光素的归一化的吸光度随pH变化图谱。(i) 3–磷酸基荧光素的pH平衡以及pK_a。通过pH滴定实验表明，3-磷酸基荧光素上有两个酸性位点，第一个pK_a高于3-磺酸荧光素，但低于3-羧酸荧光素，第二个pK_a接近生理pH值，这为其功能化提供了机会。与3-羧基荧光素相比，3-磷酸基荧光素在生理pH值下的持续电离也可能增强水溶性。

方案三，乙酰甲基酯和醚代3-磷酸二氯荧光素的合成。溴甲基乙酸酯和氧化银条件下，得到开环和闭环3-磷酸二氯荧光素两种产物，以开环3-磷酸二氯荧光素为主产物。

图二，3-磷酸二氯荧光素的细胞渗透性。(a, d) 500 nM 4孵育HEK293T细胞20 min后的细胞成像。(b, e) 500 nM 4-AM closed孵育HEK293T细胞20 min后的细胞成像。(c, f) 500 nM 4-AM open着染HEK293T细胞20 min后的细胞成像。4荧光分子不含AM酯，不能渗透细胞膜。4-AM closed的磷酸酯水解速度快由此产生的负电荷使其无法扩散通过细胞膜。4-AM open处理的细胞具有强烈的细胞荧光，表明其细胞通透性高，且具有很高的荧光强度。

图三，荧光素类荧光团的细胞保留。(a) 荧光素AMs在HEK细胞中的相对亮度比较。(b) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T细胞20 min后的细胞归一化荧光强度。(c) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T细胞20 min后的细胞成像。(d) 3-羧基羧荧光素AMs的化学结构

方案三，基于3-磷酸荧光素的膜电位荧光团的合成路线。

图四，3-磷酸基荧光素膜电位染料在细胞和体外的表征。(a) para phosVF2.1Cl在0.1 M NaOH溶液中的归一化吸收光谱(实线)和荧光发射光谱(虚线)。(a) 250 nM para phosVF2.1Cl 孵育HEK293T细胞20 min后的细胞成像。(c)在全细胞电压钳固定模式下，单个HEK293T细胞经过100 ms超极化和去极化步骤(以20 mV为增量)后，para phosVF2.1Cl (17) 在HEK293T细胞的细胞膜上荧光随时间的分数变化曲线。(d) ΔF/F 随最终膜电位变化图，显示电压灵敏度约为26%/100 mV。

总结展望

作者首次报道了3-磷酸基荧光素的合成，表征了这类新型荧光团的光谱性质，并在两个正交活细胞成像应用中使用了3-磷酸基荧光素。通过3-磷酸基荧光素的新合成路线，合成了非卤化和2,7-二卤化-3-磷酸基荧光素。其中，2,7-二氯-3-磷酸基荧光素比其他3-羧基类似物更容易溶于水。此外，合成了的5-或6-溴-3-磷酸基荧光素衍生物为电压敏感的3-磷酸基荧光素。这些新的phosVF染料具有优良的膜染色和电压敏感性，可与性能最好的VF荧光素染料相媲美。3-磷酸基荧光素将在依赖于高度细胞保留的长期成像和电压成像应用中发挥作用。

文献链接

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c01139

作者简介

Miller Evan，加州大学伯克利分校化学与分子细胞生物学助理教授2004年，拿撒勒角大学，获得生物/化学学士，哲学/神学学士。2009年，加州大学伯克利分校，获得化学博士(导师为Christopher J. Chang)。

2009-2013年，美国加州大学圣地亚哥分校从事博士后研究（导师为Roger Y. Tsien）。

2013年至今，美国加州大学伯克利分校化学与分子与细胞生物学助理教授，

研究方向包括：

化学生物学，有机化学，荧光显微镜，神经科学，成像。

编辑：韩娇娜

审核：路栩

推送：胥奔锋