为大家分享一篇发表在JACS上的文章Stapled β‑Hairpins Featuring 4‑Mercaptoproline，通讯作者是来自美国Tufts大学的Joshua A.Kritzer教授，他的研究方向主要是蛋白靶向肽及其模拟物的设计、筛选和开发。

限制性多肽是蛋白质配体的丰富来源，往往能以高亲和力和特异性结合到蛋白表面，但许多用于发现限制性多肽的方法难以运用到非蛋白性氨基酸和化学交联上，而计算设计可能是一条更直接的途径。在本文中，作者描述了由四个非蛋白性氨基酸组成的β-发夹的计算设计，并通过新的分子内交联进一步稳定。

此前，Timmerman等人开创了“CLIPS”反应，通过二溴甲苯进行半胱氨酸的烷基化，从而稳定环和α-螺旋结构，此方法也适用于D-Cys、homo-Cys、青霉胺等。作者设想使用相同的化学物质来装订4-巯基脯氨酸(4MP)。4MP是羟脯氨酸的类似物，先前被用于天然化学连接和研究脯氨酸构象。相比于Cys，4MP具有更强的扭转刚性和多达四种可用的立体异构体来改变staple的几何形状。由于脯氨酸对于β-turns结构至关重要，作者选择β-hairpin多肽HP7作为模型系统来研究4MP的装订。

先前的计算方法往往通过设计具有良好折叠的二级结构支架，然后将二硫键嫁接到已经设计的支架上，但这种策略对4MP等非天然氨基酸以及cross-linker的采样效果不佳；在本文中，作者采取了一种新思路：通过对各种装订形式进行系统建模，来找到那些兼容特定二级结构的staple，并将剩余肽段嫁接到staple上。作者使用RDKit为4MP的两种立体异构体、CLIPS反应交联剂以及Cys/homo-Cys所有可能的排列生成大量构象，并进行能量最小化。随后，在29个具有晶体结构的β-turns模板库中进行搜索，发现设计的staple与含有D-Pro和Acpc的β-turns匹配地很好，将这两个转角残基嫁接到设计的staple上即形成了装订的β-turn。最后，将装订的β-turn引入β-hairpin模式序列HP7，发现4MP的引入导致典型发夹结构被破坏，但在4MP的对侧引入D型氨基酸即可允许β-hairpin的延伸。总得来说，完整的β-hairpin序列包括设计的staple，连接的β-turn，引入的D-氨基酸以及HP7序列中的反平行β-strands。最终，进行一轮侧链设计，得到新序列4MP-m以及未装订的4MP-a。

后续对4MP-m和4MP-a的一系列实验表明，装订后的β-hairpin相比于模式序列HP7在圆二色谱中表现出更结构化的特征。尽管装订并未显著增强热稳定性，但细胞实验显示装订后的β-hairpin可以很好地抵抗蛋白酶的降解，并具有中等程度的细胞渗透性，且在30uM以内均未观察到细胞毒性。

总之，作者提供了一种新的计算方法，可运用于各种装订类型和二级结构的设计。此外，作者还展示了4-巯基脯氨酸作为订书肽组分的可行性。由于脯氨酸是包括β-hairpin在内若干二级结构的促进残基，作者预计4MP等新型残基的引入还能为药物开发提供更多独特的支架。