J. Am. Soc. Mass Spectrom|基于电子转移解离的蛋白质组学中分子内氢重排的实际影响

文章是发表在Journal of the American Society Mass Spectrometry上的Practical Effects of Intramolecular Hydrogen Rearrangement in Electron Transfer Dissociation-Based Proteomics[1]，文章的通讯作者是威斯康星大学分子生物化学和化学系的Joshua J. Coon教授。

串联质谱作为蛋白质和肽段分析的基础方法，已经开发了众多的解离方式。其中基于气体碰撞的解离是最常见的，此方法通常会断裂蛋白质的酰胺骨架键产生b/y离子。而在过去的20年里，基于电子的离子激活方式逐渐发展起来。例如，通过自由电子捕获的ECD和电子从小分子自由基阴离子转移的ETD，此类方法与基于碰撞的方法相比通常会断裂N-Cɑ键，形成c/z离子。尽管解离的具体机制存在争议，但是普遍地认为基于电子的解离方法能够保留不稳定的共价键和非共价键相互作用。因此，ECD和ETD在分析不稳定的翻译后修饰(PTMs)和完整蛋白方面特别有用。

但是基于电子的解离方法会受到前体离子电荷密度的影响，对于高质荷比的前体离子，分子内的低电荷密度使其拥有更低的库仑排斥和更多的非共价的分子内相互作用，这就导致了其具有更高的非解离电子捕获/转移(ECnoD/ETnoD)倾向，产物离子更容易络合在一起而不是发生具有序列信息的断裂。对于这种非解离的情况可以通过后续补充其他离子激活的方式得到缓解，例如碰撞、高温和光子辐射。对于ETD而言，主要有ETcaD、EThcD、AI-ETD三种，其中ETcaD采取对ETD之后的ETnoD产物离子进行共振激发，通过碰撞激活赋予足够的振动能量释放碎片离子。EThcD，在一个单独的反应池中使用宽带束型碰撞解离来激活ETD反应后存在的所有离子。AI-ETD，它依赖于在离子-离子反应的同时用红外光子照射ETD反应池。光子吸收引起的振动激活破坏了前体离子二级结构，减少了ETnoD物质的产生。此外，AI-ETD的伴随性意味着它不会增加扫描序列的额外时间，并最小化ETnoD复合物的存在时间。

虽然这些方法能够克服ETnoD的问题，但是也会产生氢重排的副反应。根据ETD的机制，通常会产生的[c + 2H]¹⁺和[z + H]¹⁺两种离子，但是氢重排后氢原子从c型离子迁移到z型离子，会产生[c + H]¹⁺和[z + 2H]¹⁺两种副产物，这不仅会导致原本的单同位素的离子峰的丰度下降，还会产生新的离子峰，扭曲肽段离子原本的同位素分布，在数据解析的过程中导致肽段单同位素峰的错配。这种副反应在低电荷密度的前体离子的解离中尤其常见，此外，氨基酸组成和局部环境对氢原子重排也起着重要的作用。除了帮助我们对每种方法的基本理解之外，测量各种ETD方法中的氢迁移行为为手动光谱解释和搜索算法的性能提供了实用的知识。此外，电子驱动激活方法的新应用不断出现，强调需要详细了解由各种激活机制产生的碎片离子。

在本文中，作者利用数千个双电荷前体离子来研究氢原子在来自HAP1人类细胞裂解物的多种胰蛋白酶肽中的迁移，比较了ETD、ETcaD、EThcD和AI-ETD对c和z型产物离子形成和同位素分布的影响，以确定活化方法、电荷密度和近端环境对分子内氢原子迁移引起的同位素分布畸变的重要性。

图1，显示了来自ETD、AI-ETD、ETcaD和EThcD的c型离子和z型离子的同位素分布。对于序列为GAEAANVTGPGGVPVQGSK (m/z = 848.44)的胰蛋白酶肽的c17+离子，氢迁移以(c17−1)+峰的形式（从[c + 2H]¹⁺变为[c + H]¹⁺）出现，比单同位素峰轻一个氢原子。由于碎片离子的不同强度以及c型和z•型离子化学之间的差异，分别将氢迁移率显示为相对[c + H]¹⁺•/[c + 2H]¹⁺强度比和[z + 2H]¹⁺/[z + H]¹⁺强度比，从而可以对碎片、碎片类型和激活方法进行全局比较。由于任何[c−1]+峰的理论强度为零，期望的[c + H]¹⁺•/[c + 2H]¹⁺比值也将为零，这意味着任何大于零的比值都代表一个扭曲的光谱。理论的同位素强度在每个面板中用实心圆圈表示。对于这个例子，ETD给出的c17+片段的[c + H]¹⁺•/[c + 2H]¹⁺比值为0.82表明即使没有添加其他的激活方式，氢也会发生迁移。AI-ETD将[c + H]•/[c + 2H]比值降低至0.70，ETcaD将[c + H]¹⁺•/[c + 2H]¹⁺比值提高至0.91，EThcD将其提高至1.07。对于EThcD光谱，理想信号为零的c−1峰超过了单同位素峰，从而进一步扭曲了谱图。含有z型碎片的c端同位素分布也可能因氢原子迁移而出现畸变。由于引入的氢原子和额外的中子质量非常相似，[z + 2H]¹⁺峰与碎片的第一个含C¹³峰重叠。对于序列为TEGLSVLSQAMAVIK (m/z 773.93)的胰蛋白酶肽的z11⁺片段，氢原子迁移导致[z + 2H]¹⁺峰超过所有四种方法的单同位素峰强度，即使理论[z + 2H]峰是单同位素峰的约60%(实圆)。ETD产生的[z + 2H]¹⁺/[z + H]¹⁺•比值为1.18，AI-ETD提供的比值几乎相同，略为1.17。相反，ETcaD增加了氢原子迁移的普遍性，使[z + 2H]¹⁺/[z + H]¹⁺为2.24，而EThcD的比率最高，为2.61。

图1. 氢迁移造成c型和z型产物离子的扭曲同位素分布。双电荷GAEAANVTGPGGVPVQGSK和TEGLSVLSQAMAVIK的c17+和z11+•片段离子的ETD、AIETD、ETcaD和EThcD的谱图比较。对于该方法，强度归一化为最高值。实心圆点表示理论同位素分布。

为了对各种色氨酸肽中氢原子迁移的普遍性进行更全面的评估，作者检查了ETD、AI-ETD、ETcaD和EThcD产生的所有片段与质量-电荷的关系(图2)。这些结果表明氢原子迁移与前体离子m/z之间存在很强的相关性。在基于碰撞的补充方法（ETcaD和EThcD）中，[c + H]1+/[c + 2H]1+和[z + 2H]1+/[z + H]1+比值几乎总是更高的，特别是在高m/z值时。AI-ETD产生的[c + H]1+/[c + 2H]1+和[z + 2H]1+/[z + H]1+值等于或略低于单独的ETD。随着前体离子m/z的增加，氢迁移的增加可能归因于库仑斥力的降低和更加紧密的蛋白质二级结构，这两者都会导致ETnoD产物的存在时间增长，使得氢有更多的时间迁移。

图2.分子内氢原子迁移与c和z型离子前体m/z的关系。氢迁移显示为所有双电荷碎片离子的[c + H]1+•/[c + 2H]1+(左)和[z + 2H]1+/[z + H]1+•(右)的平均峰面积比，饼状图显示了显示氢迁移的c型和z型同位素分布的百分比。

分子内氢原子迁移对N – C α肽键裂解周围氨基酸环境的依赖性如图3所示。“n−1”表示N-Cɑ靠近N端的氨基酸残基，而“n”则对应于肽键断裂时靠近肽C端的氨基酸残基。当主链裂解发生在n位残基含有极性侧链（D、N、Q、S、T、G）的位点时，氢重排的程度更高。对于几乎所有残基，在EThcD和ETcaD中，氢原子迁移的速度都高于AI-ETD和ETD。当这些氨基酸位于n – 1位置的氨基酸残基，对氢原子迁移的影响较小，当这些氨基酸位于键断裂的C端时，N、Q和G也会增加氢原子迁移的速度。此外与氧、氮等电负性原子成键的极性氢原子，在侧链上靠近N – Cα键解裂的位置时，更容易发生迁移。当键裂解发生在色氨酸(W)残基附近时，ETcaD的氢原子转移率相对较高。甘氨酸（G）增加了多肽结构的自由度以及键断裂位点附近可用于重排的氢原子数量。有趣的是，与AI-ETD相比，当键切割在n位置上邻近甘氨酸时，ETD对c型离子产生更高的分子内氢重排率，这表明通过展开肽并潜在地消除分子内相互作用，氢原子转移的可能性更小。

图3.分子内氢原子迁移与氨基酸环境的关系。阴影对应于20个氨基酸残基中每一个的[c + H]•/[c + 2H](上)和[z + 2H]/[z + H]•(下)的平均峰面积比。位置“n−1”表示与N−Cα肽键断裂相关的N端氨基酸，而位置“n”表示与N−Cα键断裂相关的C端氨基酸。注意，没有考虑到脯氨酸残基的N端片段。

图4为碎片离子理论单同位素峰强度与观测单同位素峰强度的积。将同位素分布中各峰的强度归一化为分布内的总强度。任何氢的迁移都会降低c型和z型产物离子的单同位素峰强度，导致积减小。因此，较高的积通常表示与理论同位素分布更相似，而分数越接近于零表示由于氢迁移而产生的不同光谱，AI-ETD谱与ETD谱更接近，而ETcaD和EThcD谱更扭曲，值更低。

图4.观测和理论同位素分布的比较表明，ETcaD和EThcD光谱中的同位素分布存在较大的畸变。(a) c型和(b) z•型离子同位素分布的理论单同位素峰强度与观测单同位素峰强度的积。理论和观测的单同位素峰强度均归一化为前三个同位素峰的总强度。

为了评估氢迁移对肽谱鉴定的潜在损害，作者对胰蛋白酶HAP1肽进行了ETD、AI-ETD、ETcaD和EThcD分析。对于相同的双电荷肽前体，在18 W激光功率下，ETD检测到62 831个c型和z型片段离子分布，而AI-ETD在ETD上增加了115%的独特碎片生成。ETcaD、EThcD与ETD相比，这些值分别提高了52%和51%。图5表明，在仅分析c和z型离子的人类数据库搜索中，ETD给出了4192个唯一肽谱匹配(psm)，AI-ETD检测到的额外c和z型片段直接转化为额外的psm，比ETD提高了113%的psm，但ETcaD和EThcD检测到的额外片段却没有。氢迁移影响了EThcD光谱，与没有任何补充活化的ETD相比，由c和z型离子制成的psm减少了17%。图5c表明，在AI-ETD谱中检测到的相对于ETD谱的额外片段离子可以转化为额外的肽识别，但ETcaD和EThcD中额外的c和z型离子不会转化为额外的识别，而且氢迁移会降低单同位素峰强度并扩大识别所需的耐受性，从而阻碍了算法的谱图解释和肽识别。

图5.氢迁移的实际影响。(a) ETD、AIETD、ETcaD和EThcD鸟枪法蛋白质组学实验产生的c型和z型片段同位素分布数量。(b)在搜索参数中仅包含c和z型片段离子时获得的唯一肽谱匹配(psm)，以及(c)仅使用c和z型离子时相应的唯一肽鉴定。百分比是相对于没有任何补充激活的ETD。

总的来说，在这项工作中，作者比较了四种不同激活模式下的氢迁移:ETD, ETcaD, EThcD和AI-ETD。后三种方法都涉及补充激活ETD产物，尽管激活离子的时间、能量和特异性不同。ETcaD和EThcD在ETD反应结束后都涉及到产物离子的振动激活，这两种后活化方法都产生了较高程度的氢迁移，特别是当D、G、N、S和T残基直接位于裂解位点的C端时。相比之下，AI-ETD通过红外光子对整个离子-离子反应进行同步振动激活，其氢迁移相对较少。AI-ETD和ETD的氢迁移曲线总体上更为相似。氢迁移事件的实际影响在LC-MS/MS人类胰蛋白酶肽数据的数据库搜索中得到了体现，三种辅助活化方法产生的c/z碎片离子总量均高于单独活化ETD;然而，更多肽鉴定的好处只在AI-ETD中实现。这是因为氢的重排改变了ETcaD和EThcD谱中的产物离子分布，这表明，人工谱图解释和数据库搜索必须适当地考虑到不同ETD碎片化方法的产物离子。

[1] Peters-Clarke, T.M., Riley, N.M., Westphall, M.S., et al. Practical effects of intramolecular hydrogen rearrangement in electron transfer dissociation-based proteomics[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2022，33(1)：100-110.