JACS | 哌嗪并二硫化物作为硫氧还蛋白的高效生物还原探针和用于硫醇氧化还原生物学的双功能试剂

给大家介绍的文章是最近发表在JACS 上的Piperazine-Fused Cyclic Disulfides Unlock High-Performance Bioreductive Probes of Thioredoxins and Bifunctional Reagents for Thiol Redox Biology，文章的通讯作者是慕尼黑大学的Oliver Thorn-Seshold。

生物学研究依赖于可用于活细胞的具有反应选择性的化学工具。氧化还原生物学仍然缺乏高质量的化学工具。高度保守的上游氧化还原酶可以为化学反应提供还原等效物，其中包括硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶系统(Trx/TrxR)中的二硫醇型氧还蛋白，谷胱甘肽系统(Grx/GSH/GR)和一些相关的二硫醇蛋白。

小分子与这些二硫醇/二硫化物化学物质具有化学相容性，在活细胞中有效且无创地起作用，并且可理想地选择性地处理某些氧化还原酶。这些试剂可以推动生物氧化还原动力学基础研究，通过氧化还原门控或代谢门控诊断和治疗。

图1. 先前的二硫化物结构以及本文结构设计

靶向这些中心二硫醇的挑战是找到具有快速靶向还原酶的二硫化物底物，但对蛋白质硫醇或较浓的单硫醇（如GSH）没有线性二硫化物所具有的一般不稳定性(图1a)。最近，在Whitesides的二硫化物热力学研究指导下，作者开发了环二硫化物单胺SS60和SS66C (图1b,c)作为二硫醇蛋白底物，在无细胞实验中对Trxs的还原具有良好的选择性。这是因为它们的拓扑结构确保了单硫醇抗性，并且六元环的热力学和动力学稳定性也可抵抗较弱的二硫醇还原酶的激活。然而，为了被细胞中的Trxs激活，被还原的二硫醇中间体的环化速率k_cyc变得至关重要(图1c):就像DTT一样，这种二硫醇中间体迅速还原了二硫化物，因此在细胞环境中，它需要特殊的k_cyc速率才能在被氧化前释放药物。然而，当SS60和SS66C被构建到荧光探针中时释放缓慢，在细胞中是不活跃的。作者还测试了使用哌嗪(P)活化，希望其局部碱性可以加速环化，由此产生的P-SS60(图1d)具有更快的激活速率，但仍不具有细胞活性。

在这项工作中，作者希望解决高选择性和高释放率相结合的挑战，开发细胞中有效的二硫醇氧化还原蛋白的还原试剂。作者结合了SS66型并环结构，并且加入邻近胺(如P-SS60)去质子化，这有利于1,2-二硫烷对Trx/Grx型二硫醇氧化还原蛋白的选择性。作者将这些特征压缩成C/T-DiThia，即顺式/反式哌嗪并环的六元环二硫化物(图2)

图2. 两种合成路线

首先是合成部分（图2），作者首先尝试从DTT出发合成但是在胺取代步骤中失败了。接着作者从丁烯二醇出发通过多步取代和保护脱保护，最终以13步，6%的总产率拿到了目标产物。接着作者优化了整个合成路线，从顺式和反式的丁烯二醇分别出发，通过硝基苯磺酰基保护的方式得到了N取代的产物，并且在后续过程中为了防止分子内硫/硒醇的S_NAr反应，作者最后使用了NaOMe脱保护，最终以六步反应拿到了产物。

图3. 底物热力学分析

接下来作者使用与DTT反应后HPLC检测的方式测定了产物的氧化还原电势，并且与先前的并环结构进行了对比。作者还使用DFT计算了还原前后的能量。从结果来看（图3），哌嗪的还原热力学与先前的哌啶非常相似。

图4. 产物衍生化结构

接着作者对产物进行了衍生化，分别使用甲基，乙酰基和哌嗪酰基（P）取代上方的N。作者合成了八种并环结构，并且与单环结构进行对比（图4）。

作者对于这些二硫化物的动力学进行了研究，分别为关环动力学和还原动力学。对于关环动力学，作者发现顺式和反式并环的速率相差不大，关键在于取代基效应。P取代的底物关环速率最快，作者认为其集合了酰基取代和邻近碱催化两个优势，其关环速率为SS60的100倍以上。接下来作者研究了还原速率，作者发现TCEP和DTT均可以还原产物而对于GSH来说，反式底物可以被还原然而顺式底物未被还原。

图5. 动力学现象的构象分析

作者分析了该动力学现象（图5）：顺式底物为双椅式并环结构而反式为椅式-船式结构。因此在与GSH反应之后，反式结构会进行一个构象翻转，使得两个S位点远离，因此不会发生可逆反应，顺式则会发生更快的分子内关环。

图6. 顺式和反式产物与二硫醇氧化还原蛋白的反应活性对比

接下来作者研究了在无细胞时底物与二硫醇氧化还原蛋白的反应活性（图6a），与动力学结果一致，反式不具有选择性而顺式底物不与单巯基反应，具有二硫醇氧化还原蛋白选择性。细胞内实验也表明反式底物对于Trx的选择性较差，会广泛地报告细胞内巯基活性。

最终作者通过替换探针为药物以及后续N的点击化学衍生化展示了该结构作为前药的潜力。

图7. N点击化学衍生化以及前药结构

综上所述，作者设计了一种哌嗪并环的二硫化物结构，两种构型的底物，反式具有快速巯基还原响应性，顺式具有双巯基氧化还原蛋白的选择性。这种二硫化物展示了作为细胞内氧化还原探针以及响应性前药的潜力。

作者：WLT

DOI: 10.1021/jacs.3c11153

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.3c11153