分享一篇发表在JACS杂志上的文章，题目为“USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK”。文章的通讯作者是西奈山伊坎医学院的金坚教授和哈佛医学院的魏文毅教授，长期致力于开发新型PROTAC技术。本文开发了基于USP7的DUBTAC，首次展示了去泛素化酶USP7可用于DUBTAC的开发。

靶向蛋白质降解（TPD）方法可以用于降解导致人类疾病发展的蛋白质。然而，人类疾病是由具有保护功能的蛋白质（如肿瘤抑制蛋白）的表达减少或功能丧失引起的，需要稳定蛋白而不是降解蛋白来对抗疾病。最近通过内源性去泛素化酶来开发去泛素化酶靶向嵌合体（DUBTAC）来去除泛素化并稳定感兴趣的蛋白质作为治疗手段。目前只有OTUB1去泛素化酶通过共价配体EN523用于 DUBTAC开发，然而，OTUB1共价配体衍生的DUBTAC可能与其他共价抑制剂存在类似的问题，例如引起毒性或超敏反应。因此，利用其他去泛素化酶进行DUBTAC的开发是能够推动靶向蛋白质稳定领域的发展。

本文报道了第一个基于USP7的DUBTAC的开发，该DUBTAC利用USP7的非共价配体选择性地稳定靶蛋白（图1A）。首先，作者选择先前报道的USP7 ligand #1（图1B），可以结合并抑制细胞中的USP7，以募集USP7去泛素化酶。USP7 ligand #1和USP7i-#4a复合物结构表明，USP7抑制剂的氨基不在结合口袋中（图1B-C），可用作linker连接。然后，将 USP7 ligand #1 与CFTR 配体（Lumacaftor）与各种连接剂连接起来，产生化合物1-13（图2A）。在这13种化合物中，只有7（MS6869）和13两种化合物可以在细胞中稳定ΔF508-CFTR突变蛋白（图2B）。使用MS6869研究基于USP7的CFTR DUBTAC的机制，值得注意的是，MS6869增加了CFTR蛋白丰度，但没有增加其mRNA水平。同时，MS6869引入后出现USP7和CFTR蛋白之间的新相互作用（图2C），随后降低了CFTR的泛素化水平（图2D）。此外，基于USP7的CFTR DUBTAC MS6869以浓度和时间依赖性方式稳定CFTR（图2E-F）。更重要的是，CFTR蛋白水平的增加可能是功能性的，因为它主要位于质膜上（图2G）。与USP7配体或CFTR 配体的共同处理在很大程度上消除了MS6869稳定ΔF508-CFTR 突变蛋白的作用（图2H）。同时，在细胞CFBE41o-4.7ΔF508-CFTR中删除USP7可以阻断MS6869稳定CFTR的作用（图2I），表明 MS6869 诱导的CFTR稳定可能依赖于USP7的去泛素化酶活性。此外，TMT标记质谱（MS）测定发现，MS6869以相对特异性的方式促进CFTR的稳定（图2J-K）。这些结果表明，USP7可用于使用非共价USP7 配体稳定靶蛋白。

为了进一步证明基于USP7的DUBTAC可以稳定靶蛋白，设计并合成了一系列基于USP7 的AMPK DUBTACs（化合物14-25），通过将USP7 ligand #1与AMPK激动剂991连接起来(图3A）。AMPK激动剂991可以结合在AMPK ADaM位点，并选择性激活AMPKβ1亚基而不是AMPKβ2亚基。测量了DUBTACs 处理后AMPK激酶的α和β亚基水平。值得注意的是，三种化合物22、23和24可以稳定AMPKβ1，但不能稳定HeLa 细胞中的AMPKβ2亚型和 AMPKα亚基（图3B）。对这些先导化合物的进一步评估表明，MS8118（化合物24）在稳定AMPKβ1方面最有效，并伴随着AMPK下游底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化升高（图3C），而AMPKβ1的mRNA水平不受影响，表明AMPK DUBTAC在翻译后水平起作用。接下来，选择MS8118代表 AMPKβ1进行进一步的功能测定。引入MS8118后USP7和AMPKβ1 之间出现新的相互作用（图3D），这导致细胞内AMPKβ1 泛素化水平降低（图3E）。此外，MS8118 对 AMPKβ1 稳定的作用可能会被USP7配体和AMPK配体（图3F）或通过消耗内源性USP7阻断（图3G），表明MS8118对AMPKβ1蛋白稳定性的影响可能是通过募集USP7去泛素化AMPKβ1。为了进一步确定DUBTAC诱导的AMPKβ1稳定是否会影响细胞功能，进行了Oil Red O染色测定作为下游读数。与AMPKβ1稳定结果一致，MS8118以及化合物23在较小程度上损害了HeLa细胞中的脂质积累（图3H）。鉴于AMPK在癌症中也发挥细胞环境依赖性肿瘤抑制作用，进一步确定了这些AMPK DUBTAC是否影响肿瘤细胞生长。值得注意的是，在集落形成试验中MS8118、22 或 23 减小了集落大小（图 3I）。

接下来，使用另一种USP7非共价抑制剂GNE6776（图1C），它与AMPK亚基具有不同的结合模式，可以抑制细胞中的USP7，作为USP7配体产生一系列新的基于USP7的AMPK DUBTAC化合物26-36（图4A）。与USP7 ligand #1衍生的AMPK DUBTAC相比，GNE6776衍生的AMPK DUBTAC对AMPKβ1的稳定性影响最小（图 4B）。相反，55（MS8655）、56（MS8656） 和 57（MS8657） 三种化合物优先增加了HeLa细胞中AMPKβ2的蛋白稳定性（图4B）。进一步的分析表明，MS8655、MS8656 和 MS8657 主要以浓度依赖性方式稳定 AMPKβ2，而AMPKβ1仅受到中度影响（图4C）。此外，AMPKβ2的mRNA 水平不受三种AMPK-DUBTAC（MS8655、MS8656 和 MS8657）的影响，表明这些化合物对AMPKβ2的翻译后调控。接下来，使用AMPKβ2的一个代表性DUBTAC（MS8657） 被用于进一步的功能测定。与MS8118 类似，MS8657引入了USP7和AMPKβ2之间的新相互作用（图4D），随后降低了AMPKβ2的泛素化水平（图4E）。此外，MS8657对AMPKβ2稳定作用被 USP7 和 AMPK 的配体（图4F）或通过内源性USP7的删除阻断（图4G）。这些结果证明AMPK-DUBTAC以USP7依赖性方式稳定蛋白底物。为了与AMPK-DUBTAC稳定AMPKβ2中的作用保持一致，这些 DUBTAC 还导致Oil Red O染色评分降低，表明HeLa细胞中的脂质积累被破坏（图4H）。此外，MS8655、MS8656 和 MS8657 处理减少了HeLa细胞的集落数量和集落大小（图4I）。总之，这些结果表明，USP7可以用于生成AMPK DUBTACs，从而有效稳定AMPKβ2，激活AMPK信号传导，减少肿瘤细胞生长。

​

图4. USP7 ligand #2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC稳定细胞中的AMPKβ2

本文基于USP7的非共价配体，开发了基于USP7的DUBTAC，其稳定ΔF508-CFTR突变蛋白与之前报道的基于OTUB1的DUBTAC具有相似的效果。重要的是，使用两种不同的USP7非共价配体，开发了第一个AMPK DUBTAC，这些AMPK似乎可以选择性地稳定AMPKβ的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。这些结果强调，除了OTUB1之外，USP7还可以用于开发DUBTAC，从而扩展了靶向蛋白质稳定和开发新型 AMPK DUBTAC 作为潜在疗法的工具箱。