Gao等人于2007年首次报道Fe₃O₄纳米颗粒可以模拟辣根过氧化物酶(HRP)并根据米氏(Michaelis-Menten)参数发现Fe₃O₄可以提供更好的活性(Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 577−583)。此后，各种纳米粒子作为过氧化物模拟酶被广泛地应用于许多重要领域。鉴于没有统一的衡量标准来评判这些过氧化物纳米酶的性能，Jiang等人定义了过氧化物纳米酶的催化常数(k_cat)为“k_{cat_P} = V_max/[P]”（[P]是纳米酶颗粒的摩尔浓度，V_max指最大反应速率），使用该衡量指标，可以得出Fe₃O₄比HRP活性更高(Nat. Protoc. 2018, 13, 1506−1520)。有趣的是，Ji等人最近实验结果显示Fe₃O₄的过氧化物模拟酶活性相比于HRP几乎可以忽略不计(Nat. Catal. 2021, 4, 407−417)；Gumpelmayer等人也认为Fe₃O₄没有过氧化物模拟酶活性(Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 130, 14974−14979)，这些发现和过去十年的研究结论明显相悖。鉴于Fe₃O₄是此领域最具有代表性的纳米酶之一，解决上述研究分歧对于未来过氧化物模拟酶的设计意义重大。

近日，香港城市大学彭咏康课题组从原子视角分析了这个争议，并提出了解决方案。通过追溯HRP的工作原理以及k_cat的定义，发现这些分歧的起因是k_cat公式中对于分母—酶浓度的表示方式各不相同。在生物酶领域中，k_cat指单个活性位点单位时间内转化为产物的底物分子数，比如具有单个铁卟啉活性单元的HRP分子，一摩尔的HRP含有一摩尔的铁卟啉，其k_cat等于V_max除以HRP的摩尔浓度。后来这个计算方式也被广泛地应用在过氧化物纳米酶的研究中。但是，与HRP不同的是纳米酶活性位点数量不仅仅与[P]相关，因此直接应用此公式会得到一些错误的结论。具体而言，对于给定的纳米酶，V_max不仅与[P]相关，也与每个颗粒的表面积(S_NP)、单位表面积的位点的密度(A)有关。以300 nm的Fe₃O₄为例，k_{cat_Fe} = V_max /[Fe]，[Fe]=[P]×S_NP×A，每个300 nm Fe₃O₄表面大约3.7×10⁶个铁原子活性位点，而每个HRP只有一个铁卟啉活性位点，因此一个Fe₃O₄颗粒具有的活性位点数远远大于一个HRP所具有的。这也就解释了为什么只考虑k_{cat_P} = V_max/[P]计算时，Fe₃O₄的活性可以高于HRP。有鉴于此，作者建议公式中的[P]应包含所有颗粒表面活性原子的浓度来公平合理地对比纳米酶的活性。

此外，该工作根据 k_{cat_Fe}重新比较了文献中不同尺寸的Fe₃O₄活性，有趣的是：如示意图2所示，大颗粒Fe₃O₄的k_{cat_Fe}比小颗粒Fe₃O₄高两个数量级左右，这一现象和普遍的认知（纳米催化剂粒径越小活性越高）相反。作者认为这一反差起因于大颗粒Fe₃O₄的多晶性质，有一些高活性的Fe原子存在于多晶 Fe₃O₄的表面晶界处。为进一步证明这一观点，作者制备了多晶Fe₃O₄（p-Fe₃O₄）与商业化单晶Fe₃O₄（s-Fe₃O₄）进行对比和探讨。作者使用TEM, SEM, XRD等技术表征s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄的形貌，尺度，结构等，通过材料对特征底物TMB催化氧化前后的吸光度变化来进行性能的测试和比较，通过米氏方程研究s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄催化的动力学过程，发现两种材料的k_{cat_Fe}存在大约两个数量级的差异。基于本课题组之前对过渡金属氧化物作为过氧化物酶的机理研究(ACS Appl. Mater. Interfaces 2022, 14, 22728−22736)：表面低价态活性金属原子与H₂O₂的氧化还原反应是决定酶促活性的关键。对Fe₃O₄而言，表面Fe(II)的数量决定了所产生的OH自由基和被氧化TMB的多寡，因此表面Fe(II)的含量与所获得的V_max正相关。相比之下表面Fe(III)与H₂O₂的氧化还原低了至少三个数量级，不仅对酶促反应的V_max没有帮助，反而在k_{cat_Fe}的分母[Fe]中有一定的占比。根据上述机理，作者提出s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄的活性差异是由于这两种材料表面活性Fe(II)和惰性Fe(III)的不同所导致的。作者接下来使用XPS,TPO等测试验证了这一猜想，得出了s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄表面Fe的分布情况和化学状态确实非常不同，即p-Fe₃O₄具有更高的Fe(II)/Fe(III)比例，并且其表面晶界处的Fe(II)具有更高的反应活性。本工作从原子水平的角度阐述了当前研究过氧化物模拟酶活性存在矛盾的根本原因，提供了一个更加合理的评价过氧化物酶活性的方法，对设计高效过氧化物模拟酶有指导性意义。

示意图1. (a,b)HRP酶由Fe(III)-卟啉和两个氨基酸(His-42, Arg-38)共同激活H₂O₂并通过氧化AH₂(两电子供体)来完成催化循环，(c,d)其他文献和该工作中提出的过氧化物模拟酶反应机理。

图2. 文献及本工作中获得的HRP和Fe₃O₄的Michaelis-Menten参数比较。

图3. s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄的结构表征。

图4. s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄作为过氧化物纳米酶的活性差异研究。

图5. (a-d) s-Fe₃O₄和p-Fe₃O₄活性差异的动力学研究, 表面Fe(II)/Fe(III)比例和Fe(II)活性研究，(e)不同尺寸p-Fe₃O₄的k_{cat_P}和k_{cat_Fe}比较。

论文信息：

An Atomic Insight into the Confusion on the Activity of Fe₃O₄ Nanoparticles as Peroxidase Mimetics and Their Comparison with Horseradish Peroxidase.

Yuwei Qiu, Bo Yuan, Hua Mi, Jung-Hoon Lee, Shang-Wei Chou and Yung-Kang Peng.

J. Phys. Chem. Lett. 2022, 13, 8872−8878. https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.2c02331