Nat. Biotechnol. | CRISPR-StAR可在复杂的体内模型中实现高分辨率基因筛选

推荐一篇发表在Nature Biotechnology上的文章，题目为“CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models”。通讯作者是来自IMBA分子工程研究所的Ulrich Elling，其课题组致力于基因组学和测序分析方面的研究。

细胞群的遗传异质性和瓶颈效应为传统CRISPR-Cas9技术在体内模型中的全基因组遗传筛选带来巨大挑战。遗传异质性指肿瘤内部的细胞并非都是相同的，它们可能含有不同的基因突变、表达水平和环境响应性；瓶颈效应在遗传筛选中意味着如果只有少数细胞能成功移植，这些细胞所代表的sgRNA可能无法准确反映整个基因库的遗传效应。两者共同作用使体内模型的CRISPR-Cas9基因筛选分辨率受限，结果噪声大、可重复性低。

为解决上述问题，本文作者开发了一种名为CRISPR-StAR（Stochastic Activation by Recombination）的新型遗传筛选技术，它通过在每个细胞克隆中引入内部对照，即通过4-羟基他莫昔芬诱导表达Cre重组酶，使其激活一半后代细胞中的sgRNA，而另一半保持非活性状态，从而在同一克隆内生成活性和非活性sgRNA的细胞，实现直接比较，提高遗传筛选的准确性和分辨率。

作者对比CRISPR-StAR与传统CRISPR-Cas9筛选方法，发现CRISPR-StAR能在低“cells/sgRNA”比值条件下靶向核心必需基因，获得可信的实验结果，且结果的可重复性高。经过优化后的CRISPR-StAR表达载体系统能在不同细胞系中以相同的比例激活sgRNA，可见该内部控制方法的稳健性。

随后，作者针对人类或小鼠构建了一个全基因组范围的sgRNA文库，并将其应用于具有显著的低移植率和生长异质性的小鼠黑色素瘤模型中，以识别对Braf抑制剂产生耐药性的关键基因。在该实验中，作者同时比对了CRISPR-StAR和传统方法在体内和体外的基因筛查结果差异，仅有体内模型的CRISPR-StAR基因筛选结果提供了可信的关键基因。这些基因在体外模型中并未呈现同样的必需性，可见在体内环境中进行遗传筛选的重要性。

总的来说，作者所开发的CRISPR-StAR技术弥补了传统CRISPR-Cas9方法在体内实验中的缺陷，提供了一种用于体内模型高分辨率遗传筛选的强大工具，这对于基础研究和临床应用都具有重要的意义。通过巧妙的内部对照设计，CRISPR-StAR技术提高了体内模型遗传筛选的准确性、分辨率和结果可靠性，为未来的基因功能研究和药物靶点发现提供了新的途径。

本文作者：WZH

责任编辑：FTY

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02512-9

原文引用：10.1038/s41587-024-02512-9