光笼化的二氢四氮在水溶液中应稳定，脱笼后的产物应迅速氧化为四氮。他们使用还原剂二氧化硫脲可将其转化为相应的二氢四嗪。1-(2-硝基苯基)氨基甲酸乙酯因其对光的敏感性和生物相容性而被选为光裂解官能团。结果表明二氢四氮不是光活化形成四氮的关键中间体。他们进一步探索底物的光活化范围，他们加入红移的可裂解保护基团，如6-硝基哌嗪甲基光笼。他们还探索了二氢四嗪上的不同取代基，结果表明四嗪取代基可以极大地影响与亲二烯烃的环加成反应速率。

对光固化二氢四嗪在水介质中的稳定性进行了表征，并与四嗪产物进行了比较。结果表明，在无辐射的情况下，光固化二氢四嗪在生物相关水溶液中具有高稳定性。尽管3-（丁基-3-炔-1-基）-6-苯基-1,2,4,5-四嗪2a在37°C的PBS或细胞裂解液中24小时内保持稳定，但带有吸电子联吡啶取代基的四嗪2e在水溶液中极易降解。他们从稳定的光笼化二氢四嗪1h中光激活生成2e的方法可以解决缺电子四嗪在水溶液中的稳定性差的问题，并发现在缺电子四氮的稳定性和反应性之间找到适当的平衡很重要。

具有生物正交手柄的肽的功能化

在合成了各种可被光激活的光笼化二氢四嗪后，他们接下来探索了特定的生物共轭应用。四嗪类化合物的一个缺点是易降解，特别是在亲核剂和碱存在的情况下。由于四嗪与固相肽合成（SPPS）反应条件不兼容，因此通常在肽合成的后期引入四嗪。在4-甲基哌啶/DMF溶液中，40%的四嗪2a在30分钟内降解。相比之下，光固化二氢四嗪1a在4-甲基哌啶/DMF溶液中稳定，在相同反应条件下未观察到任何可检测到的降解。因此，他们推测光笼化二氢四嗪在SPPS期间是可以耐受的。

细胞膜的单细胞重塑

笼化二氢四嗪时空修饰活细胞（例如通过共价标记膜脂质）是一个挑战。为了用光固化的二氢四嗪重塑细胞膜，他们将1a添加到1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺衍生物上（DPPE）形成光固化二氢四嗪二酰磷脂1k。

为了测试了1k是否能够实现活细胞的时空标记。将光笼化二氢四嗪纳入细胞膜，粘附的HeLa S3细胞在PBS溶液（含0.1%二甲基亚砜）中与60 nm光笼化二氢四嗪-二酰基磷脂1k孵育。荧光活细胞成像用于揭示激光照射细胞膜上是否发生了四嗪连接，AF488的荧光标记仅在激光照射的细胞膜上观察到，而在相邻细胞上未观察到，这说明使用光笼化二氢四嗪二酰基磷脂1k可以实现四嗪连接的精确时空光激活。最后，为了测试空间光激活的稳健性，在0.75 mm×0.75 mm区域内的四个不同位置的一个或两个细胞群体被选择性激光照射405 nm以触发四嗪结合，从而改变相关细胞膜。荧光标记仅在激光照射的细胞上观察到，这表明通过表面四嗪的光活化可以实现对活细胞的可靠时空标记。

总之，他们展示了一种四嗪的光活化方法，该方法能够实现生物分子标记、单细胞精确的活细胞膜时空修饰以及与点击释放策略相结合的光药理学。他们的方法使用光来激活笼状四嗪前体，所以可以实现高时空精度。通过修饰细胞表面的磷脂，他们证明了单细胞激活是可行的。该技术可以通过控制脂质上的笼状四嗪在何时何地被激活，并通过双亲修饰荧光团标记后跟踪其转运，从而监测活细胞中的脂质转运和动力学。

本文作者：YXQ

责任编辑：FJY

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https://doi.org /10.1038/s41557-022-00963-8