与通过可逆地结合蛋白质来调节生物学功能的常规对应物相比，与它们的靶蛋白质形成共价键的候选药物尚未得到充分研究，部分原因是担心脱靶反应性。但是，与脱靶反应性相关的毒性可以通过使用仅在结合特定蛋白质时才朝共价键形成激活的潜在亲电试剂来最小化。于此，美国斯克里普斯研究所Jeffery W. Kelly和K. Barry Sharpless等人研究了磺酰胺基亚氨基氟化物，这是一类经历硫（VI）氟化物交换化学的弱亲电子试剂。成果Using sulfuramidimidoylfluorides that undergo sulfur(vi) fluoride exchange for inverse drug discovery该研究论文发表在Nat. Chem.上

在传统的药物发现方法中，筛选大量的小分子，以确定其修饰分离的靶蛋白或特定细胞表型功能的能力。这些方法可以产生通过共价和非共价机制发挥作用。由于脱靶毒性的考虑，与靶点形成共价络合物的药物历来被避免使用，但它们相比非共价抑制剂增加了作用时间、降低剂量要求和减少耐药性的方面有潜在的好处。因此，作者开发了一种反向药物发现(IDD)策略，该策略包括单独对一小组不同的有机化合物进行反应，这些化合物具有弱的，但可激活的亲电试剂，与细胞裂解液中的人类蛋白质组进行反应，以识别目标蛋白。这种方法仅使用少量轻度反应性化合物就能识别人类蛋白质组中的亲核位点。

在这里，作者将IDD方法应用于磺酰胺酰氟(SAFs)，它的蛋白质组在反应之前从未被评估过。作者探索了一种假说，SAFs是通过两步SuFEx反应过程制备的(图1a)。首先，烷基或芳基伯胺与四氟亚硫酰(SOF4)在标准温度和压力下，在两种等效有机碱存在下反应生成相应的亚氨基硫氧化二氟化。接下来，在三乙胺存在的情况下，仲胺取代剩余的氟化物，以产生相应的SAF(图1a)。与乙腈中的芳基氟硫酸盐相比，SAFs的亲电性降低可能是因为S=NR键取代了S=O键，这增加了SAFs中硫周围的电子密度，从而使氟与硫之间形成更强的键。

在这项研究中，作者使用亲和色谱-质谱法将SAFs与其发生反应的人类蛋白(s)匹配。作者证明了结构上不同的SAFs与不同的人类蛋白质组反应。最后，作者将SAF与聚(ADP-核糖)聚合酶1 (PARP1)匹配，证明了PARP1在体外和活细胞中的共价抑制作用，潜在地补充了用于改善癌症的非共价PARP1抑制剂。

SAFs与人类蛋白质发生反应。

作者研究了人类蛋白质组与16种含SAF-化合物的反应性(图1b)。化合物1-16包含大部分未发表的含有末端乙炔的SAFs。作者有意不去选择与特定蛋白质家族结合的基序。每个SAF单独与HEK293T细胞裂解液孵育18小时。给定的SAF与目标蛋白之间的反应程度在24小时内呈线性增加(补充图1)。因此，我们选择18小时的孵育时间作为实际的实验时间点，以捕获足够数量的SAF偶联蛋白。值得注意的是，化合物1-16对SDS-PAGE检测到的人蛋白质组具有不同的反应活性，结果表明这些化合物的平衡结合片段是决定偶联过程选择性的关键因素。为了更全面地调查形成的偶联物和检测低丰度偶联物，我们使用了定量液相色谱-串联质谱(LC-MS /MS)。

图1

蛋白质组学鉴定了SAFs 1-16的靶点。

为了鉴定SAFs 1-16靶向的人类蛋白，作者将16个蛋白质组标记反应(25°C孵育18小时)与还原可切割的叠氮化合物进行CuAAC反应。随后对SAF结合蛋白进行富集。用二亚硫酸钠(Na2S2O4)洗脱链霉亲和素树脂中的结合蛋白。然后用胰蛋白酶消化富集的蛋白质，并进行串联质量标签(TMT)标记15，使LC-MS /MS对SAF-蛋白偶联物相对于用二甲基亚砜(DMSO)处理的蛋白质组细胞裂解液样品(作为载体，但其他处理方法相同)进行定量(图2a)。结果进一步表明这些蛋白对SAFs有反应。

图2

三个靶蛋白上的SAF-反应位点。

为了进一步了解SAF的结合位点，作者将三个纯化的蛋白与SAF反应，用于在已知活性位点抑制剂存在的情况下从人类蛋白质组中识别SAF(图3)。结果表明，SAF探针与Pro1或附近的残留物发生反应。通过对MIF·13偶联物的LC-MS /MS分析，进一步证实了这一结果。以类似的方式，加入已证实的EPHX2非共价抑制剂1-三氟甲氧基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)尿素(TPPU;重组EPHX2 (3μM)与9 (50μM)反应后，荧光信号明显减弱(图3g)，表明9占据了酶的活性位点。这个位点包含两个酪氨酸残基，Tyr383和Tyr466，它们可以水解某些脂类环氧化合物。这两种催化残基似乎都是SAFs和EPHX2之间可能发生反应的位点，因为它们都对硝化反应敏感。

图3

SOF 在体外抑制 PARP1 活性

试图确认与SAF探针的反应抑制了酶的活性。作者检测了PARP1在特定SAFs存在时的活性，除了23个SAFs外，所有SAFs都具有共同的丙炔胸腺嘧啶结构(图4a)。在添加NAD+之前，将PARP1与激活的受损DNA和SAF化合物预孵育20分钟，结果PARP1受到了有限的抑制，但值得注意的是，23表现出了显著的抑制(图4b)。然而，反应18小时后，2和5的抑制效果显著(图4b,c)。结果表明，简单地用SAF亲电试剂修饰已知蛋白质配体的现有结构通常不会导致偶联反应，这就强调了SAF正确定位的重要性。

图4

SAF2抑制HeLa细胞中PAR的合成

为了研究SAFs是否抑制活细胞中的PARP1活性，作者用2,5或奥拉帕尼处理HeLa细胞24小时，然后加入H2O215分钟诱导PARP1的磷酸化。在此期间未观察到细胞死亡。细胞裂解后，使用识别PAR和PARP1的抗体免疫印迹法测定PAR修饰的程度。与单独使用5或载体处理的细胞不同，使用2处理的细胞显示PAR修饰的程度和PARP1自动化的大幅减少(图5a)。正如预期的那样，奥拉帕尼治疗(阳性对照)导致了PAR合成的全部消融。2在细胞中抑制PARP1活性的能力是值得注意的，因为它的结构并没有优化细胞通透性，也没有通过药物化学的努力与PARP1结合。

为了检查细胞活性，作者对HeLa细胞进行奥拉帕尼或2的治疗24小时。然后清洗细胞，加入不含抑制剂的新鲜培养基6小时。然后通过H2O2处理诱导PARP1活性。2的处理方案保留了大部分的PARP1抑制活性，而奥拉帕尼活性显著降低(图5b)，这表明2偶联抑制PAR合成。

图5

研究表明，磺酰胺基亚氨基氟化物与蛋白质的平衡结合可以允许特定氨基酸侧链的亲核攻击，从而导致共轭物形成。

研究人员将小分子与人细胞裂解物一起孵育，每个小分子带有一个磺酰胺基亚氨基氟化物亲电试剂，并通过亲和色谱-质谱法鉴定了形成的蛋白质结合物。这种反向药物发现方法鉴定了一种化合物，该化合物与活细胞中重要的抗癌靶标聚（ADP-核糖）聚合酶1共价结合并不可逆地抑制其活性。

【文章链接】https://www.nature.com/articles/s41557-020-0530-4

【DOI号】https://doi.org/10.1038/s41557-020-0530-4