接下来，我们测试S89是否直接接合MFNl。当S89与纯化的MFN 1-MGD（包括G和HB 1结构域）一起孵育时，该蛋白的GTP酶活性没有改变（图a）。同样，MGD的核苷酸依赖性二聚化不受S89存在的影响。然后我们纯化了全长MFN 1，发现S89有效地将MFN 1的GTP水解加速了约2倍（图a）。人MFN 2的GTP酶活性比MFN 1弱得多（图a）。与细胞试验一致，S89不能影响MFN 2的活性（图a）。总之，这些结果表明MFN 1是S89的直接靶，但靶向区域可能在MGD之外。S89相互作用的候选区域在MGD和TM结构域之间，并且预测主要是螺旋（即HB 2），S89直接靶向MFN 1的HB 2中的环区。接下来，我们使用纯化的全长MFN 1通过微尺度热泳（MST）测试S89-MFN 1相互作用。测得这两种分子之间的亲和力约为6 μM（图b）。正如预期的那样，结构相似的化合物S3未显示出与MFN 1的相互作用（图b）。类似地，当MFN 1从细胞裂解物中沉淀出来并与这些小分子一起孵育时，高效液相色谱法（HPLC）检测到S89的保留，而不是S3。这些结果证实S89特异性地结合MFN 1。MST分析进一步证实，L1或L1-2对MGD的亲和力相似，约为1-2 μM（图c），这也相当于S89-MFN 1相互作用。总之，这些结果表明S89和G结构域共享HB 2环中的识别位点，即两个中心苯丙氨酸（Phe）残基。

为了测试S89和G结构域是否竞争HB 2环相互作用，我们分析了在S89存在下的G-HB 2相互作用。在BLI中，当存在S89时，L1-2肽与MGD的缔合容易减少。通过基于荧光共振能量转移（FRET）的试验进一步评估竞争，其中G结构域用一种荧光团（G位点）标记，肽用另一种荧光团标记（图d）。MGD的标记是有效的，并且不改变GTP酶活性。提前检测了仅供体、仅受体和供体+受体的原始光谱。当G位点标记的MGD与标记的L1-2肽一起孵育时，FRET信号较高，然后当加入S89时，FRET信号显著降低（图e）。当在HB 1（HB位点）末端标记MGD时，除了FRET水平低于G位点外，获得了类似的结果，证实了肽可能附着于G结构域而不是HB 1。因此，S89似乎通过破坏HB 2环和G结构域之间的分子内缔合而变构解锁MFN 1。接下来，我们测试了MFN 1是否通过核苷酸加载而天然引发。当GTPγS（一种不可水解的GTP类似物）与MGD一起加入时，L1-2肽在BLI系统中吸引的MGD较少。一致的是，添加GTP或GTPγS（而非ATP）会立即减少MGD-肽与G位点或HB 1位点相互作用引起的FRET信号（图e）。这些结果表明GTP加载可以在解锁MFN 1中实现与S89类似的效果。值得注意的是，全长MFN 1的GTP水解被S89促进至与MGD相同的水平，其中不存在分子内锁定，表明S89可能通过克服分子内抑制而完全激活MFN 1（图h）。我们预期用Ala取代具有锁定能力的Phe将增强MFN 1的活性。与野生型相比，MFN 1 FF/AA突变体表现出更高的GTP酶活性（图g）和增加的融合活性（图f）。重要的是，突变体介导的融合不能被S89进一步增强（图f），因为S89不再与MFN 1结合。这些结果表明，S89的作用可通过G相互作用α8-α9环L1-2中的诱变解锁MFN 1进行表型复制（图 h）。

我们测试了添加S89是否对线粒体损伤的细胞有益。线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）综合征是由编码线粒体转移RNALeu（UUR）的线粒体基因A3243 G突变引起的，该突变导致线粒体能量产生缺陷和断裂。通过将野生型和A3243 G突变线粒体DNA转移到无人线粒体DNA的ρ°206细胞中，产生稳定的异质性MELAS样胞质杂种。在名为ρ°206_B的细胞系（含有约90%突变线粒体DNA）中，严重断裂（图a）伴随线粒体活性氧（ROS）水平升高（通过mitoSOX测定）（图b）和明显的线粒体去极化（通过膜电位敏感性MitoTracker橙子显示）（图c）。加入S89后，这些缺陷恢复到与ρ°206_A细胞相似的水平（线粒体DNA为100%野生型）（图a-c），并且有效地修复了ATP产生的缺陷（图d）。这些结果表明S89在MELAS样细胞环境中恢复线粒体相关功能障碍。已知化学毒素百草枯（PQ）会导致细胞内过氧化氢（H2 O2）蓄积和线粒体功能障碍。当U-2 OS细胞用浓度递增的PQ处理时，很容易检测到线粒体断裂（图e）。当同时加入S89时，细胞H2 O2和ROS的升高以及ATP产生的损失大大减轻（图e-h）。值得注意的是，即使S89挽救了线粒体的形态学缺陷，但由于PQ（1.5 mM）造成的损伤过多，功能损伤（去极化）无法挽救。关于S89的保护作用，S89的3小时工作窗口仍然很大（图i，j）。PQ或S89处理未影响线粒体重塑蛋白水平，证实S89对现有蛋白的作用。这些结果表明，S89可以快速有效地修复受损的线粒体。铁依赖性程序性细胞死亡的一种特殊形式–铁细胞凋亡与线粒体功能障碍有关。当GPX 4的抑制剂RSL 3诱导铁死亡时，我们测试了S89。通过碘化丙啶（PI）染色检测，S89共处理有效增加了细胞存活率。同时，S89可减少RSL 3引起的线粒体断裂和去极化（图l，m）。线粒体片段化（在4小时）比细胞死亡的起始（10-12小时）早得多。当在RSL 3处理后4-6小时加入S89时，由RSL 3引起的细胞死亡显著减少，但在RSL 3处理8小时后，S89对挽救细胞无效（图n）。综上所述，结果表明S89在修复线粒体损伤和预防药物诱导的铁蛋白沉着方面是有效的。

最后，我们从两名携带显性MFN 2突变（R94 W或T105 M）的CMT 2A患者和两名健康亲属（作为对照）中产生诱导多能干细胞（iPSC）。在这些细胞中验证了突变和多能性。值得注意的是，在MFN 2突变的细胞中，内源性MFN 1水平升高，可能是由于代偿作用（图a）。这些iPSC然后分化成运动神经元，如通过已知的HB 9和ChAT标志物所证实的。野生型运动神经元形成具有几个突出轴突的细胞体簇，但源自患者细胞的神经元具有严重的轴突病（图b）。此外，患者细胞中的线粒体表现出缩短、缺乏嵴结构、轴突中密度和移动性降低以及高水平的去极化，所有这些都通过添加S89校正至接近对照细胞的水平（图c-f）。这些结果表明，S89可以逆转来源于CMT 2A患者的神经元细胞中的线粒体缺陷。

在缺血/再灌注（I/R）期间，线粒体经历过度的碎片化和线粒体渗透性转变孔开放，产生功能障碍的线粒体并使心肌细胞倾向于程序性细胞死亡。因此，增强的线粒体融合预期在心脏I/R损伤中是有益的。为了检查S89在体内的心脏保护作用，我们在小鼠模型中在再灌注之前结扎心脏30分钟，并且在再灌注的同时在结扎周围的两个损伤区域处将S89注射到心脏中（图a）。S27，其非常类似于S89，但对线粒体融合没有影响，和盐水用作对照。I/R损伤后24小时，收获小鼠心脏并切成5个切片（图a）。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）和伊文思蓝双重染色法评估心脏组织损伤程度（图 b）。对照组中容易观察到危险区域和梗死区域，但S89处理组中不常见（图b，c）。这些结果表明S89在小鼠I/R损伤期间提供了即时心脏治疗。接下来，我们分析了损伤后2周S89的作用，此时S89可能逐渐消失。值得注意的是，通过超声心动图（ECG）测量，S89处理保留了心脏功能（图d-f）。此外，Masson三色染色显示，S89减少了心脏中的瘢痕形成（图g，h）。心脏组织的电子显微镜分析显示，S89可有效防止I/R损伤诱导的线粒体断裂和肿胀（图i，j）。线粒体融合减少伴随着融合机制表达减少和Drp 1过度激活，通常通过S616磷酸化和/或S637去磷酸化。在对照处理的损伤心脏中，MFN 1/2和OPA 1（线粒体内膜融合原）水平降低，Drp 1 S637磷酸化水平也降低，这与线粒体断裂增加和线粒体健康缺陷一致。S89注射在很大程度上防止了这一点损伤后，线粒体融合蛋白和ATP合酶脂质结合蛋白Atp 5a的水平基本保持不变，尽管损伤诱导的Drp 1活化没有变化。最后，我们测试了S89是否对小鼠的一般健康状况有副作用。经S89浸泡的Matrigel注射液对体重无影响，生理盐水和S89处理小鼠的血液、肾脏和肝脏功能生化试验显示无明显差异。白色细胞和淋巴细胞计数以及IL-1β和IL-6水平轻微降低，这在小鼠注射小分子时常见。总之，这些结果表明S89治疗对心脏I/R损伤具有总体有益作用。