分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章：Real-time imaging of protein microenvironment changes in cells with rotor-based fluorescent amino acids，通讯作者是来自莱斯大学的Han Xiao，该课题组的研究方向是开发各种化学生物学工具，去了解复杂的生物系统并开发新的治疗策略。

蛋白质的微环境变化可以触发伴侣结合、蛋白质聚集等与细胞调节途径或者一系列疾病密切相关的过程。荧光蛋白与环境敏感荧光团的融合已被广泛用于研究蛋白质微环境的变化。不幸的是，这些技术通常依赖于靶蛋白的N端或C端的大荧光蛋白或标签，这会破坏靶蛋白的行为，并可能限制它们以高空间分辨率研究微环境变化的能力。为了克服这些困难，本文作者利用遗传密码子拓展技术在靶蛋白的特定位置掺入含有基于转子荧光团（RBF）的、环境敏感的非经典氨基酸，来实时可视化蛋白质亚结构的微环境变化。

转子荧光团对环境变化做出反应，在低粘度溶剂中，RBF的电子供体和受体之间富含π的碳-碳键的内部旋转导致荧光激发非辐射消散。增加环境的粘度会抑制必要的扭曲分子内电荷转移，从而增强RBF在高粘度环境中的荧光发射。在蛋白质的特定位点上引入RBF，可以用于监测特定蛋白质结构域的局部环境刚度。作者选择了旋转连杆和扩展Anap的偶联系统，设计了一系列基于转子的荧光ncAA（RBF-ncAAs）。

作者使用Anap作为潜在支架，首先引入旋转连接子来生成对环境粘度变化具有强敏感性的RBF。此外，作者通过延长荧光团内部的电子共轭并引入吸电子基团来延长荧光团的发射波长。插入乙烯单元作为分子转子，然后将该motif与甲氧基-酮、甲基-酮或噻吩-酮偶联，生成三种 RBF-ncAA，包括 AnapMo，AnapMe和AnapTh。与Anap相比，三种 ncAA 都显示出更明显的红移荧光和吸光度，它们增强的分子内电荷转移导致其发射波长在不同极性溶剂中的溶剂变色偏移更大。除了这些荧光氨基酸对环境极性的响应显著增强外，分子转子的引入还赋予了这些新的Anap类似物，特别是AnapTh的强烈粘度响应性。

随后作者为AnapTh设计相应的aaRS。由于Anap的aaRS对AnapTh的插入效果并不理想，所以作者使用计算方法来预测结合口袋并修改AnapRS的活性位点。计算结果暗示配体与酶活性位点内的两个环之间存在空间冲突，表明这些区域是底物识别不良和催化效率低的主要原因。这两个环中有七个残基，包括Leu522、Pro523、Val524、Asp525、Pro559、Val560 和 Lys561。于是作者对这些位点进行突变的筛选，最终获得效果最好的AnapThRS。

作者在构建好ncAA和相应的aaRS之后，选择了几个靶蛋白进行了研究，包括hSOD的聚集，Htt片段的颤动，STIM1 cluster追踪以及CRY 光遗传学cluster监测等。

总而言之，本文作者开发了基于转子荧光团的ncAA和相应的aaRS，用于实时监测蛋白质微环境变化。

本文作者：MB

责任编辑：LZ

DOI：10.1038/s41589-025-02003-1

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-02003-1