分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，标题为“SNAP-tag2 for faster and brighter protein labeling”，通讯作者是来自德国马克斯普朗克研究所的Kai Johnsson和Julien Hiblot，他们的主要研究方向均为蛋白质工程、酶进化和生物传感技术。

SNAP标签利用化学合成的荧光基团进行蛋白质标记，是生物成像的的强大工具。然而，其相对缓慢的标记动力学和底物有限的细胞通透性限制了其在活细胞中的应用。因此，作者对SNAP标签及其标记底物进行了工程化改造，使其能在体外和活细胞中更快地标记蛋白质。

SNAP标签中的半胱氨酸残基可以与O6-苄基鸟嘌呤（BG）或氯嘧啶（CP）的衍生物发生亲核取代反应，使蛋白产生荧光标记。SNAP的反应底物可分为两个部分：离去基团和连接染料与标签的接头部分，因此，作者首先分别对这两个部分进行了改造。作者合成了17种连接到四甲基罗丹明（TMR）的杂环化合物，并测试其体外与SNAP-tag的反应动力学和细胞标记性能，发现三氟甲基取代的嘧啶（CF3P）具有最好的反应效果；作者还测试了12种不同的接头，发现其中的氟衍生物效果最好。基于这些结果，作者将二者组合得到了新的SNAP反应底物，并命名为TF-TMR，比CP-TMR在体外的标记速率快3.9倍，而在活细胞中快1.7倍。

随后，作者使用定点突变、计算设计和定向进化的方法对SNAP-tag进行改造。具体来说，作者使用计算方法PROSS来识别可以影响SNAP标签稳定性的蛋白，并由此发现SNAP标签的N端具有一个损害蛋白质稳定性的非结构化区域（残基37-54）。因此，作者利用RosettaRemodel设计了一个短的8残基环，作为这个非结构化区域的替代品。对于定向进化，作者通过对氨基酸残基进行饱和诱变创建了SNAP标签两个不同区域的蛋白质文库，这两个区域分别为活性位点近端的β链（残基29-36）和活性位点环（残基155-161），均为底物结合区域。随后，作者利用酵母展示技术和荧光分选进行文库的筛选，最终得到SNAP-tag2。与SNAP-tag相比，SNAP-tag2包含11个氨基酸替换和一段用8个氨基酸取代18个氨基酸的无序区域替换。SNAP-tag2与TF-TMR的反应速率比SNAP-tag与CP-TMR的反应速率提高了100倍。并且，SNAP-tag2在标记后展现出了更高的吸光度，表明SNAP-tag2可能具有更高的能力将染料转变为两性离子荧光状态。

​

最后，作者测试了改进的SNAP-tag2底物对在活细胞成像中的应用；作者发现，SNAP-tag2在U2OS细胞中标记速度显著提高；在超分辨率显微镜成像中，SNAP-tag2标记的线粒体和中间纤维显示更高的荧光信号和分辨率；而在酵母中，SNAP-tag2标记过氧化物酶体的效率显著高于传统SNAP-tag。并且，SNAP-tag2可以与Halotag7兼容进行双色成像。

总之，作者对SNAP标签和标记底物分别进行了改造，显著提高了SNAP标签的标记动力学和标记亮度。

本文作者：ZCL

责任编辑：MB

DOI：10.1038/s41589-025-01942-z

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01942-z