推荐一篇发表在Nat Chem Biol上的文章，文章题目为“Serine ADPr on histones and PARP1 is a cellular target of ester-linked ubiquitylation”，文章通讯作者为科隆大学马克斯-普朗克老龄化生物学研究所的Ivan Matić老师，他们课题组的研究方向主要是利用蛋白质组学技术研究DNA损伤和衰老过程中ADPr修饰的动态调节过程及其作用。

蛋白质翻译后修饰的动态调节和相互之间的串扰是精确调节细胞信号网络的核心机制，近年来，有研究通过体外实验发现E3泛素连接酶DELTEX可以催化游离ADP-核糖、核酸及蛋白上的ADP-核糖发生泛素化修饰，但是不清楚该修饰的细胞内靶标是什么。由于该修饰是通过化学不稳定的酯键连接，因此难以被捕获和鉴定。于是本文针对这种复合修饰量身定制了蛋白质组学策略，探索了细胞内该修饰发生的位点。

此前的研究发现E3泛素连接酶RNF114通过zfDi19锌结合结构域识别并结合单ADPr修饰，且RNF114同时具有泛素相互作用基序（UIM），作者猜测RNF114可能作为ADPr和泛素化修饰的阅读器发挥作用。于是作者截取了RNF114的C端zfDi19-UIM（ZUD）结构域，与GFP偶联，期望通过GFP-ZUD富集ADPr修饰上带有泛素化修饰的蛋白。同时，作者还从三个方面对质谱制样流程进行优化：为了减少非特异性吸附，作者富集之后，用EDTA洗脱，EDTA会夺取zfDi19锌结合域中的锌离子，使其无法与ADPr修饰结合，从而将带有ADPr修饰的蛋白洗脱；为了保留ADPr和泛素之间的酯键，作者使用ArgC和LysC组合的短时间酶切方式对洗脱的蛋白进行处理；为了减少IAA在K上发生双重烷基化，产生与与泛素化GlyGly残余质量数几乎完全相同的+114 Da人为修饰，作者使用的氯乙酰胺替代IAA进行封闭。

对质谱制样流程进行优化之后，作者发现了一些ADPr和泛素化复合修饰的位点，但是总体修饰肽的丰度还是很低。作者建立了特异性的质谱采集方法，通过对已有数据的分析，作者发现相比于ADPr修饰，ADPr-泛素化修饰会产生特征的碎片离子。

针对该复合修饰的碎裂特征，作者设计了双触发质谱策略：首先在快速、低质量的HCD谱图中检测到腺嘌呤，以触发中等质量HCD谱图的采集，检测到Adenosine-GlyGly或者ADP-GlyGly会触发高质量的MS2谱图的采集。

​

通过已建立的质谱样品制备、质谱采集方法流程，作者成功鉴定到PARP1的S499、S519和H3S10、H3S28上的ADPr-泛素化修饰，并通过实验验证了该修饰在体内的存在。

最后，作者将ZUD结构域改造成了一个模块化的分子生物学工具，用于免疫印迹分析ADPr-泛素化修饰。

综上所属，本文作者针对ADPr-泛素化修饰开发了量身定做的蛋白质组学策略，鉴定了细胞内该修饰发生的靶标，并开发了模块化工具，用于免疫印迹分析ADPr-泛素化修饰。

本文作者：LZ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41589-025-01974-5

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01974-5