分享一篇于今年3月发表在Nature Communication上的文章，题目为“DNA-based platform for efficient and precisely targeted bioorthogonal catalysis in living systems”。本文工作由中国科学技术大学、中国科学院长春应用化学研究所稀土资源利用国家重点实验室、化学生物学实验室的曲晓刚研究团队开展。曲晓刚研究员课题组主要致力于化学与生物学交叉研究领域，研究方向包括化学调控生物分子构像与功能、药物与靶分子作用机制、新型人工酶开发及应用、生物功能材料、手性识别与生物催化等。近年来，曲晓刚研究员课题组结合生物正交反应和新型生物功能材料，在助力疾病靶向治疗方面做了很多有趣的工作。本文中，作者设计并构建了一种基于DNA的生物相容、高效靶向的生物正交纳米催化剂。该纳米催化剂在体外和体内均表现出优异的催化效率，可特异性地在癌细胞中实现有效的前药活化，从而增强了药物抗肿瘤功效。
作为典型的生物正交反应之一，一价铜催化的叠氮炔基环加成（CuAAC）反应已被用作生物偶联官能团和分子的强大工具，在温和条件下具有快速动力学和高产率，但活性催化物质 Cu(I) 的固有毒性会损害正常细胞和健康组织并引起许多副作用，且缺乏靶向性，从而限制了其在活体生物系统中的应用。DNA 具有生物相容性、可编程性、易于合成和修饰等优异特性，还可以作为模板合成金属纳米团簇或纳米粒子，通过 SELEX 技术选择的适配体、单链 DNA 或 RNA 序列以高亲和力和特异性识别结合细胞表面的靶标，并通过受体介导的内吞作用提高细胞摄取。这些特性为基于DNA平台设计生物相容、高活性和靶向生物正交催化剂提供了机会。
受上述背景启发，作者开发了一种基于单链DNA的铜纳米粒子 (CuNPs)，作为生物相容的CuAAC反应高效靶向纳米催化剂（图1a）。其中，单链 DNA 由三个结构域组成：（1）富含胸腺嘧啶的序列可作为模板形成CuNPs，作者在此选择了不同长度的胸腺嘧啶链T20、T30 和 T40；（2）可以靶向癌细胞高表达蛋白（如粘蛋白 1， MUC1)的适配体；（3）一个 15个碱基的linker链。根据胸腺嘧啶链长短的不同将相应纳米粒子命名为Apt-Cu20、Apt-Cu30和Apt-Cu40。CuNPs可通过适配体对癌细胞的靶向性，高浓度富集于癌细胞，从而于癌细胞原位催化带有叠氮炔基基团的前药分子使其活化，从而实现癌症的靶向治疗（图1b）。
为了实现上述思路，作者首先合成以 DNA 为模板的 CuNPs（Apt-Cu）。透射电子显微镜（TEM）表征显示CuNPs 是单分散的（图 1c-e），尺寸在1.5 nm-5.5 nm之间（图 1f ）。zeta电位测量显示CuNPs带负电（图 1g ）。X 射线光电子能谱 (XPS) 光谱有效显示Cu 2p的能谱峰（图 h）。此外，CuNPs 在 340 nm 激发时呈现 600 nm 的荧光发射，且随着胸腺嘧啶数的增加，荧光强度显著增加（图1i）。以上结果表明作者成功合成了以 DNA为模板的 CuNPs。
图1. DNA 模板化CuNPs 作为生物正交催化剂的设计、合成和基本表征
然后，作者在体外评估合成的Apt-Cu系列纳米催化剂对CuAAC反应的催化性能。作者选择在催化剂存在下将无荧光的前体1（3-叠氮基-7-羟基香豆素）和2（苯乙炔）转化为带有强荧光的三唑3作为模型反应（图 2a）。所有三种Apt-Cu 纳米催化剂在340 nm 激发下均可诱导460 nm 处的荧光，且荧光强度Apt-Cu30展现出最佳的催化活性（图2b）。在没有纳米催化剂的情况下，荧光在这段时间内保持恒定。加入纳米催化剂后，荧光立即出现（图 2d, e），表明其具有优异的催化活性。分子对接结果显示前体1和2通过与DNA之间的疏水相互作用来稳定结合（图 2f, g）。除此之外，Apt-Cu纳米催化剂在不同生理条件下均展现出优越的催化能力（图 2h），表明该纳米催化剂十分适合应用于生物体系。
图2. 体外评估合成的Apt-Cu系列纳米催化剂对CuAAC反应的催化性能
在确认Apt-Cu 在体外的催化活性后，作者接下来进一步测试其对特定细胞类型的靶向能力。作者将Apt-Cu与粘蛋白MUCI 的适配体偶联构建靶向癌细胞MUCI的CuNPs ，简称为MApt-Cu30 ，同时将没有适配体区域 DNA 链 (WA-Cu30 )合成的 CuNPs作为对照。作者使用 MUC1高表达的人肺癌细胞A549和人乳腺细胞MCF-7作为靶向的细胞模型，将MUC1 低表达的人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞MDA-MB-231作为阴性对照，同时对比正常细胞中的大鼠成纤维 NIH 3T3细胞、鼠巨噬细胞RAW 264.7和人胚肾细胞HEK293。激光共聚焦结果显示，与MApt-Cu30孵育的MUC1阳性细胞在绿色细胞膜内呈现出强烈的红色荧光，而MUC1 -细胞和正常细胞红色荧光微弱，表明MApt-Cu30可以区分特定类型的癌细胞和正常细胞（图3a）。此外，流式细胞分析也呈现了相似的结果（图 3b, c），从而证实了 MApt-Cu30对特定类型细胞的靶向识别。
随后，通过使用共聚焦显微镜监测细胞膜染料-DiO（绿色）、CuNPs（红色）和产物三唑3 （蓝色）的信号，确定了 MApt-Cu30靶向癌细胞进行催化的能力。和MUC1低表达的MDA-MB-231细胞相比，MUC1高表达的MCF-7细胞中有更多的MApt-Cu30积累，且前体1和2被有效催化向蓝色荧光的三唑3转化（图4a, b）。流式细胞仪分析表明，MApt-Cu30处理与没有MApt-Cu30的细胞相比，用前体1和2孵育的 MUC1 阳性细胞中，蓝色荧光增加了 180 倍以上（图 4c, d）。上述结果证明，三唑3的较高催化产率可归因于适配体介导的细胞选择性和 CuNPs催化剂的靶向积累。
图4. 特定类型细胞中MApt-Cu30催化的 CuAAC 反应
作者在证明了MApt-Cu30对MCF-7细胞和A549细胞的优越靶向性和催化性能后，进一步将其用于细胞内催化CuAAC反应以实现前药活化，增强对上述两种细胞的靶向杀伤。作者使用抗癌药物白藜芦醇（3,5,4′-三羟基芪；Rsv）类似物作为模型药物，合成了分别带有叠氮、炔基基团的前药4 , 5，然后利用 MTT 分析来研究4 , 5和所得 Rsv 类似物6的细胞毒性。在不存在MApt-Cu30的情况下，前药4和5在各种细胞中几乎没有细胞毒性（图5a）。添加MApt-Cu30后，MUC1 +细胞的细胞活力显著下降，而MUC1 -细胞和正常细胞则略有下降（图 5b）。这表明Rsv类似物6可以在CuNPs的催化下合成，并对细胞产生细胞毒性。对 MUC1 的细胞毒性差异+细胞和 MUC1 – / 正常细胞由 MUC1 适配体的特异性识别产生。双染色流式细胞仪分析显示MUC1 +细胞的死亡主要与细胞凋亡有关（图 5c）。上述结果表明，MApt-Cu30可以通过催化CuAAC显著促进前药活化，从而增强对MUC+癌细胞的抗肿瘤功效，同时对正常细胞具有很低的副作用。
图5. MApt-Cu30特异性催化MUC+癌细胞中CuAAC反应用于前药活化
最后，受到细胞实验有效结果的鼓舞，作者将该体系应用于荷瘤裸鼠模型，以期实现体内前药活化用于肿瘤靶向治疗。作者建立了MCF-7荷瘤的无胸腺裸鼠模型（图 6a），同时，建立以MUC1-细胞系为特征的MDA-MB-231荷瘤无胸腺裸鼠模型作为对照。在治疗过程中监测每组的体重和肿瘤大小（图 6b, c），证明4 + 5 + MApt-Cu 30在MCF-7肿瘤模型中大大降低了肿瘤生长速度并表现出高效的抗肿瘤能力（图 6d）。染色分析显示凋亡细胞显著增加，表明肿瘤细胞严重受损并充分减少，而对正常组织几乎没有副作用（图 6e）。
图6. MApt-Cu30催化CuAAC 反应用于荷瘤裸鼠模型前药活化和肿瘤靶向治疗
综上所述，本文作者成功设计和构建了一种基于 DNA的生物正交反应纳米催化剂，在体外和体内前药活化和癌症靶向治疗中表现出良好的生物相容性、优异的催化转化和特异性细胞识别。鉴于可以通过更换不同的适配体来实现实现灵活的细胞特异性靶向，本文体系可以作为一种简单而有前途的癌症个性化治疗方法。
文章作者：TX
原文引用：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29167-x
责任编辑：LD
