今天给大家推荐的文章是最近发表在Nature Communications上的Light-induced primary amines and o-nitrobenzyl alcohols cyclization as a versatile photoclick reaction for modular conjugation，文章的通讯作者是中国科学院大学和中科院上海药物研究所的陈小华研究员。
点击化学作为一种简便、高效、快速的反应类型，在合成化学，尤其当今在生物研究、模型药物研究、纳米技术与材料科学等领域，具有十分重要的地位。在近十年间，科学家们在点击化学领域进行了诸多研究，其中生物正交的点击反应始终是药化等领域的有力工具，常见的生物正交点击反应包括NCL反应，胺生物偶联，以及硫(IV)-氟交换反应等。然而，此类自发生物偶联点击反应在复杂的生物环境中一般来说仍然难以做到定时定点反应。
光活化是一种十分理想的化学反应途径，其优势包括操作便捷、无需有害金属离子及配体参与、高时间与空间分辨率等。近来，在时空精准的光诱导点击化学方面，虽然科学家们已经有了许多发现，但能够实际投入应用的依旧有限，常见的有四氮唑的光点击反应已经被应用在材料领域和生物体系中。一般光点击反应中需要解决的主要问题包括反应选择性，以及量子产率的提高，即高效性等。另外，诸多光点击反应前体的复杂实验室合成方法也限制了其应用。
在此，作者介绍了一类采用邻硝基苄醇（o-NBAs）与一级胺进行环化的光点击反应（PANAC），该反应能够在温和的条件下高效进行，并且适用范围广泛，具有相当的时空可控性与化学选择性，反应前体同样简单易得（图1）。因此，PANAC化学为分子偶联提供了一类新的简单高效易操作的点击化学平台。
图1. PANAC反应示意图
在文章中，作者在对带有芳环的光活性底物的筛选中发现，芳环上的取代基极大影响着反应效率。而带有吸电子酰胺键取代的底物能够与一级胺实现最高的反应产率（图2c）。通过对反应的研究，证明了该反应在瞬时光照后即可快速生成亚硝基苯中间体，并且在随后的几分钟内稳定反应，（图2d, e）最终在近中性及弱碱性条件下实现目标产物产率，且在极低底物浓度下已经能够顺利高产率反应（图2f）。
图2. 对PANAC模型反应的筛选与优化
在对体系底物广泛性与基团耐受性的实验中，作者证明了多种小分子药物或类似物（例如氨氯地平，阿霉素，3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶）能够几乎定量反应。此外，在醇、酚、羧酸、二级及三级胺、含氮杂环存在的条件下，反应均能够以极高产率完成。
随后，作者采用PANAC方法对未保护的肽段进行了标记与环化偶联，并实现了时间控制。采用未保护的肽段进行实验，作者首先发现了PANAC反应在肽段中对赖氨酸的高选择性（图3a）。并且根据图3b，在同一体系中没有光照的条件下，PANAC反应并不会发生。在图中所示半胱氨酸残基上的巯基反应，或酪氨酸残基上的酚羟基反应结束之后对体系进行光照，PANAC反应方才发生。由此可见，该反应也能够简化肽段与蛋白的保护-脱保护步骤，使操作合成更加高效简洁。与之相比，例如活化酯与芳基磺酰氟之间的点击反应受到其他亲核基团的干扰更大。
图3. PANAC在未保护肽段上的标记与环化反应
随后，作者以天然蛋白为目标反应物，进行了PANAC生物偶联反应的体外实验。作者采用nanobody-HER2为模型蛋白对其进行标记（图4a），反应在30分钟内完成。胰蛋白酶消化蛋白后进行质谱表征分析与凝胶电泳-荧光分析，显示反应为赖氨酸位点特异，且反应完全（图4b, c, d）。另外，对进行过修饰的天然蛋白，例如肌红蛋白，溶菌酶与α-糜蛋白酶原A，同样有良好的偶联结果（图4e）。随后测试进过修饰的nanobody-HER2与SK-Br-3细胞系的结合能力，以HER2阴性的MDA-MB-468细胞为对照，显示PANAC修饰不影响HER2的蛋白活性（图4f）。同样采用HER2，作者还采用局部光照的方法证明了PANAC反应能够实现的空间可控性（图5）。
图4. 以HER2为模型，PANAC生物偶联反应的体外实验
图5. 以HER2为模型，PANAC生物偶联反应的空间可控性
最后，作者评估了PANAC方法的生物相容性。其中的主要担忧在于强光辐射可能对细胞状态有害。所幸短时间的365 nm光辐照在不伤害细胞状态的条件下，能够在1-4 μM浓度邻硝基苄醇底物的条件下完成偶联反应，并且能采用与先前类似的方法完成光诱导的活细胞内内源性激酶与线粒体的靶向标记。
综上，作者在本文中介绍的新型生物正交点击反应PANAC偶联具有如下优势：（1）良好的生物相容性与高反应速率；（2）拥有简单易得，且修饰方式灵活的光活性底物；（3）时间可控；（4）优越的化学选择性与高反应效率；（5）能够直接标记天然生物分子。因此，该反应十分有望成为新一代高效生物偶联平台，在材料合成、生物医药等领域均有广泛应用前景。
作者：ZY 审校：ZZC
DOI: 10.1038/s41467-020-19274-y
Link: https://www.nature.com/articles/s41467-020-19274-y
