分享一篇发表在 Nature Communication 上的文章：“Visualization of lysosomal membrane proteins by cryo electron tomography”，其通讯作者是来自宾夕法尼亚大学医学院药理学的 Vera Y. Moiseenkova-Bell 教授，她的研究方向聚焦于瞬时受体电位 (TRP) 通道的结构功能解析，并以冷冻电镜探究其调控机制及疾病关联。

一、开发并优化完整溶酶体分离方法，通过靶向 TRPML1 和 TMEM192 并结合 1D4 表位标记，实现适用于冷冻电子断层扫描（cryoET）的溶酶体纯化。

首先，为建立适用于结构分析的完整溶酶体分离方法，作者尝试优化现有 LysoIP 方法，构建稳定表达 TMEM192-3xHA 的 HEK 293 细胞系，但发现洗脱组分中溶酶体特征细胞器丰度低、污染严重，无法满足需求（Fig. 1）。为了改善纯化效果并确保目标蛋白的精准定位，研究团队选择 TRPML1 和 TMEM192 为靶点，构建稳定过表达 TRPML1-mNeonGreen-1D4 或 TMEM192-mCherry-1D4 的细胞系，并采用 1D4 表位替代 HA 标签；通过荧光显微镜验证，二者与溶酶体标志物 LAMP1 共定位系数分别达 91.5% 和 81.5%，证实定位精准（Fig. 1b、c）。随后，研究者在冷冻电镜网格上培养细胞，结合冷冻共聚焦显微镜识别阳性溶酶体，再用 cryoFIB-SEM 制备薄片。原位 cryoET 分析显示，阳性细胞器直径约 600 nm，具溶酶体典型异质腔内内容物，膜结构完好，证明过表达未改变溶酶体的天然形态（Fig. 1d-f）。

为验证 1D4 介导的免疫纯化效果及纯化细胞器纯度，研究者通过 Western blot 发现纯化的 TRPML1-mNeonGreen-1D4 和 TMEM192-mCherry-1D4 阳性细胞器中，溶酶体标志物（LAMP1、NPC1 等）显著富集，其他细胞器标志物几乎未检出，足以证实纯化的特异性（Fig. 2）。接着，研究团队通过定量质谱技术解析了纯化溶酶体的蛋白质组组成。具体的，作者对 TRPML1-mNeonGreen-1D4 细胞系进行三次重复纯化，通过 6 重 TMT 标记分析，共鉴定 1256 种蛋白，其中 280 种与内溶酶体相关，还筛选出 CLN3 等溶酶体贮积症相关关键蛋白（Fig. 2c）。为对比 1D4 与 HA 表位的纯化效率，他们以 TMEM192-3xHA 细胞系的 HA 纯化作对照，经 10 重 TMT 标记分析发现，1D4 纯化的内溶酶体蛋白富集率达 75%-85%，HA 纯化仅 5%；冷冻电镜观察进一步显示，纯化细胞器无其他污染，直径与类别分布符合内溶酶体特征，印证纯化方法高效可靠（Fig. 2d、Fig. 3）。

考虑到溶酶体膜结构分析和验证纯化样本是否保留天然膜特征的重要性，作者对纯化的 TRPML1-mNeonGreen-1D4 和 TMEM192-mCherry-1D4 阳性溶酶体进行 cryoET 数据采集，共获取 617 组 TRPML1 阳性细胞器倾斜系列图像，56 组 TMEM192 阳性细胞器倾斜系列图像作为对照。重建的断层图显示溶酶体具典型异质膜漩涡与腔内囊泡，与前期原位观察一致，证实样本适合后续结构分析（Fig. 4）。然后，为了明确溶酶体膜上关键功能蛋白的种类与分布状态，研究团队在两种阳性溶酶体膜上识别出 V-ATP 酶、Flotillin、Clathrin 三种膜相关蛋白，且经前期 Western blot 和质谱验证其存在；同时观察到 V-ATP 酶 V1 域朝外且分布无规律、Flotillin 随机分布、Clathrin 呈开放笼状，初步揭示蛋白分布特征（Fig. 4、5e）。而且，研究者通过模板匹配定位蛋白颗粒，子断层平均获得三者密度图，优化后 Flotillin（C44 对称）、Clathrin（C6 对称）分辨率分别达 13.8 Å、26.6 Å，与已知结构吻合，确认解析可靠性（Fig. 5）。此外，团队还观察到疑似 VPS13C、驱动蛋白等结构，为后续研究提供方向，但因颗粒少、异质性高未完成平均分析