分享一篇2023年发表在Nature Communications上的文章，题目是“Two-photon fluorescence imaging and specifically biosensing of norepinephrine on a 100-ms timescale”。文章的通讯作者为华东师范大学化学与分子工程学院化学系田阳教授。
神经递质在维持生理过程方面起着至关重要的作用，例如调节新陈代谢，参与神经调控和影响器官功能。特别是，当神经递质从突触前膜释放，通过突触扩散到邻近神经元，并与突触后神经元膜上的受体结合时，神经元之间的信号传导就会发生。例如，多巴胺（DA），肾上腺素（EP）和去甲肾上腺素（NE）是一类基于儿茶酚胺的结构相似且可相互转化的神经递质，其中NE在其相互转化过程中处于中心位置。因此，NE被认为是脊椎动物中枢神经系统中的关键神经递质之一，去甲肾上腺素能传递的功能障碍与一系列神经退行性和精神疾病密切相关，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、抑郁症等。尽管它在各种生理和病理生理过程中的重要性得到公认，但以高灵敏度和高时空分辨率监测生命系统中的瞬态NE动力学仍然是一个艰巨的挑战。
在此，设计并合成了一种新型小分子荧光探针（BPS3，图 1），带有两个由烷基链连接的苯基吡啶，不仅保证了良好的水溶性和灵活的分子构象，而且还表现出优异的细胞膜靶向性。 此外，引入末端S-对甲苯硫代碳酸酯作为NE的触发基团，可以进行顺序亲核取代，然后分别与NE的特征伯氨基和β-羟基发生环化反应，实现了优异的选择性 向 NE 而不是其他两种儿茶酚胺神经递质（EP 和 AD）。
在添加NE的情况下，在缓冲溶液中对探针BPS3进行荧光滴定实验。 如图 2a 所示，随着 NE 的逐渐加入，探针在 480nm 处的荧光强度相应降低，几乎达到加入 300nM NE 时的最小值（约初始值的 23%）。 图 2b 绘制了荧光强度变化率（ΔF/F0）与 NE 浓度的关系图，在 0-200nM 的浓度范围内表现出良好的线性，检测限评估为 0.5nM（3σ/S，其中 σ为探针样品的标准偏差（S.D.），n⟩=⟩20，S为校准曲线的斜率）。值得注意的是，即使对于通常与 NE 无法区分的儿茶酚胺神经递质，即 DA 和 EP，它们的干扰也可以忽略不计（与目标分析物 NE 相比，DA 为 4.1%，EP 为 8.6%，图 2c）， 验证了 BPS3 对 NE 的卓越选择性。
图3a显示了5 μM探针BPS3在水溶液中与100 nMNE反应获得的动力学数据，其中探针在480 nm处的荧光强度在与NE混合后立即降低，并在100 ms内达到平台（绿色曲线）。如图 3b 所示，在来自硼苯基的质子 H1,2 和来自硫代碳酸酯苯基部分的质子H11,13 之间发现了一对 NOE 信号，证实了两个末端基团的空间接近性，这是折叠的典型特征 构象。 此外，对探针BPS3不同构象的理论计算也证实，折叠构象比拉伸或准正交构象具有相对较低的能量。 折叠构象的更高稳定性可以通过基于 Hirshfeld 分区 (IGMH) 分析的独立梯度模型进一步合理化（图 3c），它显示出明显的范德瓦尔斯相互作用和苯环之间的 π-π 堆积效应（绿色层状） 在拉伸结构中未发现的区域）。 此外，与拉伸构象相比，BPS3的硫代碳在折叠构象中具有更大的Hirshfeld电荷值（图3d），表明其具有更强的亲电性，更有利于亲核取代反应。
如上所述，探针BPS3可以在100 ms内完成水溶液中NE的检测。然而，如果通过与二甲基甲酰胺（DMF）混合将系统中的水馏分降低到50%，则需要大约120秒才能完成与NE的反应（图4a，紫色曲线）。为简洁起见，将水中涉及BPS3-F的反应途径称为路径1，将涉及BPS3-S的反应途径称为路径2。如图（图4b），过渡态的理论研究表明存在渐进和级联的亲核取代-环化途径。在两条路径（路径 1 和路径 2）中，在水性环境中观察到涉及 BPS3、NE 片段和水分子之间各向异性氢键的反应坐标，其中活性水分子充当质子转移的分子桥 通过分子间六元环过渡态的形成（路径 1 中的状态 TS6 和路径 2 中的状态 TS3，在图 4c 中）。
如图 5a 所示，BPS3 和 DiI 的两个发射通道的荧光分布重叠良好，Pearson 相关系数高达 0.93，表明其在神经元细胞膜靶向方面具有出色的能力。如图 5b 所示，最初，两组神经元在神经元细胞膜处均表现出强烈的荧光发射。然而，当一组仅用PBS缓冲液处理，而另一组用高浓度钾处理时，两组的荧光强度差异很大，即前者的荧光强度几乎保持不变，而后者的荧光强度变化很大 在 2s 内显着增加，表明该组神经元细胞膜上的 NE 快速增加（图 5c）。细胞内钙浓度的增加进一步导致含有 NE 的囊泡迁移和融合到细胞膜，在那里它们最终被胞吐到突触间隙中（图 5d）
综上所述，本文开发了一种新型双光子激发小分子荧光探针 BPS3，它能够在单个活神经元水平上实时监测和成像去甲肾上腺素，具有高选择性和灵敏度，源自特定的顺序亲核取代环化触发 反应。 更重要的是，这种开发的探针可以精确靶向神经元细胞膜，细胞膜是突触的前沿细胞器，直接参与神经递质的分泌和摄取，在神经信号的传递中起着极其重要的作用。 该探针最显着的特点是令人印象深刻的高时间分辨率，可以在 100ms 内响应 NE，这是迄今为止报道的 NE 小分子荧光探针中检测速度最快的。 基于综合实验和理论分析，揭示了一种独特的双重加速机制，即分子构象折叠和水桥接，显着降低了探针与NE之间反应的活化能，从而提高了反应速率更多 分别是 105 倍和 103 倍。 得益于探针出色的时空分辨率，成功地将其应用于神经元 NE 反应及其在高钾刺激下的动态成像，首次在秒级时间尺度上捕捉到神经元细胞膜上 NE 浓度的快速升高 小分子荧光探针。 更重要的是，脑组织切片的影像学研究进一步显示 AD 小鼠的 NE 水平下调，这可能是由于 AD 病理下神经元的去甲肾上腺素能功能受损。 此处展示的结果不仅为 NE 检测提供了一种优越的分子成像工具，有利于高级神经科学研究，而且还揭示了双重加速机制，可能进一步为生物、分析、有机和物理化学家在研究中带来新的灵感。 超快检测和反应动力学规定。
