OGT由一个包含13个四肽重复序列（TPR）的N端结构域和一个C端催化结构域组成。TPR通常参与蛋白质-蛋白质相互作用，已知OGT的TPR结构域与许多结合伴侣相互作用。它还在底物选择中起着直接作用。OGT的13个TPR形成一个细长的超螺旋，其疏水腔内衬有保守的天冬酰胺和天冬氨酸“梯子”。蛋白底物和相互作用伙伴的非结构化区域在OGT的TPR腔内结合，在那里它们通过从天冬酰胺分子阶梯残基到肽骨架的双齿接触锚定。天冬氨酸阶梯残基和接触底物侧链的其他残基提供一定程度的底物和位点选择性。

试图定义哺乳动物细胞活力所需的最小TPR长度使用可诱导删除内源性 Ogt 的MEFs，作者设计了细胞系来评估一系列TPR截短的OGT变体支持生长的能力，发现可以维持细胞活力的最短TPR截断变体仅包含13个完整TPR中的8个。尽管这种截短的变体保留了细胞培养中活力所需的功能，但它在许多方面都存在缺陷。因此，本文工作强调了OGT的五个N端TPR在调节许多功能（包括适当的核定位）中的关键作用。

截断TPR结构域的OGT变体在HeLa细胞提取物中显示糖基化活性降低。作者使用HeLa细胞提取物来评估的OGT截断变体的糖基化活性。细胞提取物具有代谢活性，因此作者用细胞提取物孵育纯化的OGT-WT或截断的OGT变体(图2A)，然后免疫印迹检测O-GlcNAc修饰。与OGT-WT相比，所有截断的变异均显示糖基化程度降低，糖基化程度随着TPR长度的增加而降低(图2B)。

作者又设计了iCre MEFs来表达OGT-WT和TPR截断的OGT变体的mKate2-2×FLAG融合体(图2A)，并通过免疫印迹证实了每种变体的表达(图2D)。尽管对mKate2阳性细胞进行了分选，但观察到OGT结构的表达水平存在实质性变化。OGT-4和OGT-5变体的表达水平与内源性OGT相似，但与其他异位变体相比，表达水平较高。OGT-6、OGT-7、OGT-8的表达水平低于异位OGT-wt。

为了测试TPR截断的OGT变体维持活力的能力，在诱导OGT缺失后追踪了iCre MEF的融合10天。在内源性OGT仍然存在的对照实验中，所有细胞系的生长速度相似，这意味着OGT-4和OGT-5的表达升高对细胞本身没有毒性。发现没有异位OGT的细胞在内源性OGT敲除后几天停止增殖并死亡，而添加异位OGT-WT可挽救细胞活力。

虽然具有7个或更少tpr的异位OGT变体在诱导OGT敲除后无法恢复生长，但表达含有8个完整tpr的变体(OGT-8)的细胞在处理后10天存活(图2E)。作为细胞活力的正交测量，在OGT缺失后定期进行CellTiter-Glo测定三磷酸腺苷(ATP)(图2F)。在缺乏异位OGT或表达具有7个或更少tpr的OGT变体的细胞中，ATP水平在第3天左右趋于稳定，在基因敲除后第10天降至基线水平。相反，表达异位OGT-8或OGT-WT的细胞在第10天仍然存活并具有代谢活性。这些实验表明，表达缺乏前5个tpr的OGT变体的细胞是有活力的，并且可以在细胞培养模型中增殖。因此，OGT-8必须执行支持细胞生长所必需的关键OGT功能。

细胞O-GlcNAc水平不能决定TPR截断变异的生存能力差异。接下来，作者检测了表达TPR截断变体的细胞的O-GlcNAc。在体外，OGT-8表现出比短截断变体更高的糖基化活性(图2B)。作者在Ogt缺失后的第2天和第4天收获了表达TPR截断变体的iCre细胞。免疫印迹分析O-GlcNAc水平显示，与表达异位OGT-WT的细胞相比，表达TPR截断变体(包括OGT-8)的细胞O-GlcNAc在所有细胞系中均降低(图3A)。

在Ogt缺失4天后分析iCre MEFs的一个问题是，表达不能挽救生长的Ogt变异体的细胞处于死亡过程中(图2E和2F)。为了确保对Ogt变异体的观察不会与导致细胞死亡的过程相混淆，作者设计了iCre-dTAG MEFs来表达不可降解的OGT-WT复制体或TPR截断变体(图2B)。在没有异位OGT的背景条件下，所有截断变体的表达都促进了增殖。免疫印迹分析O-GlcNAc水平与表达异位OGT-WT的细胞相比，表达TPR截断变异体的iCre-dTAG MEFs中O-GlcNAc水平大幅降低(图2C)。与OGT-WT相比，表达OGT-8、OGT-7和OGT-6的细胞中O-GlcNAc水平降低反映了它们较低的酶活性和低表达水平。OGT-5和OGT-4表现出良好的表达，但由于糖基化引起的信号仍然很低，这与体外实验结果一致(图2B)。因此得出结论，全局O-GlcNAc水平不能决定细胞的生存能力。

因此，作者研究了截断变异的定位，以评估细胞活力是否与野生型样定位相关。首先证实，仅TPR结构域就足以在MEFs中实现核定位。正如预期的那样，在iCre-dTAG MEFs中，mKate2-2×FLAG标记的仅TPR变体(OGT-TPR)定位于细胞核和细胞质，在细胞核中具有较高的相对信号(图4A)。OGT-WT(图4B)显示了类似的定位。然而，当野生型OGT的背景拷贝被降解时，仅TPR的变体不能在细胞中正确定位。相反，它在原子核周围形成了一个独特的轮廓(图4A)。为了测试这种表型是由于全长OGT的缺失还是O-GlcNAc的缺失，用OGT抑制剂OSMI-4处理细胞，再次观察到核周围仅TPR-变体的积累(图4A)。荧光标记的OGT-WT变体在OGT抑制下没有显示出核周积聚(图4B)。得出结论，TPR-纯变体的适当亚细胞定位依赖于O-GlcNAc，并表明其积聚是由于与核周区域中糖基化的蛋白质相互作用。

接下来，作者表征了iCre-dTAG MEFs中TPR截断变异体的亚细胞定位。活细胞共聚焦显微镜显示，包括OGT-8在内的所有TPR截断变异主要定位于细胞质，在细胞核中只有微弱的信号(图4C)。这些TPR截断变异的定位不受FKBP12-OGT-WT背景拷贝存在的影响。这些结果表明，OGT的5个N端tpr是正确定位到细胞核所必需的。因此得出结论，它不足以在MEFs中进行核定位。为了测试它是否在核定位中起作用，设计了iCre- dTAG MEFs来表达一个全长OGT变体，其中包含三个丙氨酸来代替DFP基序(OGTDFP→AAA)。活细胞共聚焦显微镜显示，OGTDFP→AAA变异与OGT-WT一样，定位于细胞核和细胞质，具有较高的相对核信号。这一发现证实了OGT的TPR截断变体错定位的观察结果:OGT的DFP基序在MEFs中不作为核定位信号。

通过分析每次命中的胞室GO项，作者考虑了TPR截断时相互作用物丢失的可能性，即TPR截断变体的错误定位。虽然TPR截断后核蛋白命中百分比下降，但所有截断变异体都拉低了核蛋白。例如，60%的OGT-8命中在一定程度上定位于细胞核，而大约75%的OGT-WT命中。因此，截断变异的错误定位并不妨碍它们与完整细胞和/或裂解后的核蛋白相互作用。研究结果表明，OGT-WT和截断变体的相互作用伙伴的差异在很大程度上是由于tpr数量的不同。由于大多数OGT-WT命中未发现与OGT截断相互作用(图6C)，因此5个N端tpr对于与大多数野生型OGT已知蛋白伴侣稳定相互作用是必需的。

总的来说，此实验研究结果证实了OGT的TPR结构域在其蛋白-蛋白相互作用中的重要性，并表明5个N端TPR对于稳定许多这些相互作用是必要的。与它们的重要性相一致的是，残基保守分析表明，这5个N端tpr，而不是其他一些tpr，在生物体之间高度保守。在整个进化过程中，N端tpr显然在OGT功能中起着关键作用。