分享一篇发表在Structure上的文章，题目为“Structural basis for DCAF2 as a novel E3 ligase for PROTAC-mediated targeted protein degradation”。通讯作者是来自Frontier Medicines的Dr.Vikram Narayan 和Dr. Weiru Wang。他们的研究领域主要包括结构生物学、药物发现、药物设计、蛋白质结构以及基于片段的先导化合物发现等。

靶向蛋白降解技术已成为一种革命性治疗策略，它通过利用泛素-蛋白酶体系统选择性清除疾病相关蛋白。自二十多年前首次提出以来，该技术采用名为PROTAC的双功能分子或分子胶，将靶蛋白（新底物）与E3泛素连接酶拉近，触发泛素化及随后的蛋白酶体依赖性降解。尽管人类蛋白质组包含600余种E3连接酶，目前大多数PROTAC研究仍集中于CRBN和VHL等少数几种。

DDB1及其与Cullin相关因子组成的DCAF蛋白是泛素-蛋白酶体通路的关键组成部分，它们作为底物适配器使Cullin-RING泛素连接酶能够识别并标记特定蛋白以实现降解。DCAF2在多种癌症中过表达，使其成为肿瘤特异性干预策略的理想靶点。然而，由于公开结构数据的缺乏，该蛋白的开发潜力一直受到限制。本研究通过开发重组DCAF2蛋白制备方法，成功解析了DCAF2:DDB1:DDA1复合物的冷冻电镜结构。

作者鉴定出可选择性靶向DCAF2上C141位点的共价片段，并据此设计了靶向BRD4的双功能工具分子。进一步，解析了DCAF2:BFM:BRD4三元复合物结构，证实这些双功能分子在生化实验和细胞环境中均能通过DCAF2_C141介导BRD4降解。这些发现为将DCAF2开发为PROTAC驱动的靶向蛋白降解中E3连接酶底物受体奠定了结构基础。

研究人员利用 Frontier Medicines 的 Druggability Atlas 平台，结合 isoTOP-ABPP 实验数据和 AI 结构预测，对超过 90% 的人类蛋白质组进行筛选。发现 DCAF2 是一个有前景的候选靶点，其上的半胱氨酸残基（C141、C367 和 C710）可被共价修饰。通过 AlphaFold2 模型和结构比对分析，确认 C141 位于 WD40 结构域的溶剂暴露面，且其周围残基在 DCAF 家族成员中具有高度多样性，表明其可作为小分子靶向的特异性位点。CRL4 复合物结构模型显示 C141 靠近 E2 泛素结合酶，这种空间位置有利于通过正确定位和取向促进新底物的泛素化。

由于DCAF2 是一个具有 730 个残基的蛋白质，其 C 端区域（残基 416-730）是无序的，这导致重组蛋白表达溶解度低。通过与其生理结合伙伴 DDB1 和 DDA1 共表达，并排除无序区域，作者成功获得稳定、可溶的 DCAF2:DDB1:DDA1 复合物，用于结构研究。此外，作者进一步解析了该复合物 3.3 Å 分辨率的冷冻电镜结构，揭示了 DCAF2 的 WD40 结构域采用经典的七叶 β-螺旋桨结构，其 N 端通过环和螺旋结构锚定在 DDB1 的疏水腔中，形成了广泛的极性和疏水相互作用。C141 位于 WD40 结构域的溶剂暴露表面，远离 DDB1，其附近有一个浅口袋便于配体结合，且邻近一个具有相当大灵活性的环（残基 192-214）。DDA1 在解析的结构图中不可见，表明其与 DDB1 的相互作用是瞬时且动态的。

研究人员进一步通过文献挖掘筛选出化合物 1 (CL95) 和化合物 2 (CL102) 作为工具化合物进行验证。利用完整蛋白质质谱确认化合物 1 和 2 主要诱导单一、时间和剂量依赖性的 DCAF2 共价修饰，并通过通过肽段图谱实验确认这些配体的修饰位点是 C141。

最后研究人员通过将靶向DCAF2_C141的化合物1与BRD4抑制剂JQ1连接，构建了双功能分子，系统探索了不同长度和刚柔性的连接链，得到了化合物3和4。通过冷冻电镜解析了DCAF2:BFM:BRD4三元复合物结构（3.4Å），发现BFM能有效桥接两个蛋白，BRD4直接停靠在DCAF2表面，形成超过400Ų的蛋白-蛋白界面。BFM修饰的CRL4 (DCAF2)能有效介导BRD4的多聚泛素化，而单独的DCAF2配体无此功能。通过COFFEE方法将预组装的DCAF2:BFM复合物电转入细胞，实现了BRD4的有效降解，该过程依赖Cullin/蛋白酶体途径。化合物4的降解效果优于化合物3，可能与连接链特性有关。

总之，该研究证实DCAF2_C141可作为TPD的可行靶点，为开发基于DCAF2的治疗性降解剂奠定了基础。未来需要进一步优化获得具有细胞渗透性的高效降解剂，并在疾病相关模型中进行验证。

本文作者：CZH

责任编辑：LYC

DOI：10.1016/j.str.2025.09.006

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.str.2025.09.006