中科院青能所丛志奇组 Chem Sci| 工程化非天然P450过加氧酶实现苯乙烯的高度(R)-对映选择性环氧化

摘要

手性环氧化合物是医药和精细化学品的重要中间体，不同于天然苯乙烯单加氧酶实现了(S)-氧化苯乙烯>99% ee的对映选择性，目前天然氧化酶或工程化酶依然很难实现(R)-氧化苯乙烯的高对映选择性控制。本文利用P450酶的半理性设计和双功能小分子（dual-functional small molecule, DFSM）协同P450催化策略有机结合（图1），调控苯乙烯及其衍生物的不对称环氧化，(R)-氧化苯乙烯的对映选择性可达99% ee。该研究表明通过蛋白质工程和外源DFSM分子的协同作用，可为酶促(R)-氧化苯乙烯合成提供了新的途径，同时可拓展P450酶的催化应用范围。

内容

手性环氧化合物是医药和精细化学品的重要中间体，烯烃的不对称环氧化是合成该化合物最经济、简洁的方法之一。尽管基于化学催化和生物催化的不对称环氧化取得了重大进展，但目前绝大数催化体系仅实现了(S)-氧化苯乙烯对映选择性的优异控制。近年来，研究者们利用天然酶或工程酶（如天然苯乙烯单加氧酶、定向进化改造P450酶和过加氧酶等）进一步提升(R)-氧化苯乙烯的对映选择性，但(R)-氧化苯乙烯的高对映选择性控制仍是挑战。

最近，丛志奇课题组开发出一种双功能小分子（DFSM）协同P450过加氧酶催化策略，该策略中双功能小分子一端的咪唑作为“催化功能基团”，发挥酸碱催化作用协助血红素活化H₂O₂；另一端为带有酰基氨基酸的“锚定功能基团”，通过与P450BM3的多重氢键特异识别作用把小分子固定到活性口袋。在苯乙烯环氧化研究中发现，双功能小分子 N-(w-咪唑基)-己酰基-L-苯丙氨酸衍生物（N– (w-imidazolyl)-hexanoyl-L-phenylalanine, Im-C6-Phe）的化学干预作用可使P450BM3-F87A催化苯乙烯环氧化R构型的对映选择性从8% ee提高至84% ee。因此，在上述基础上，本文利用P450酶的半理性设计和双功能小分子协同P450催化策略有机结合来进一步提升苯乙烯环氧化R构型的对映选择性。

在前期研究中发现，双功能小分子协同P450催化策略可解除一般NAD(P)H依赖P450酶对高度保守位点T268（对氧活化至关重要）的限制，而T268位于血红素活性中心的最近端，对底物结合构象有明显地调节作用（图2）。于是首先对T268位点与双功能分子Im-C6-Phe的综合协同作用进行研究。结果显示，在NAD(P)H体系，不添加Im-C6-Phe的对照组，F87单突变F87A/G/V催化苯乙烯环氧化的对映选择性较差（表1、1-3行），而且引入T268V突变后，与预期一致，双突变F87A/T268V、F87G/T268V、F87V/T268V的活性大幅下降，因此在NAD(P)H体系下难以通过T268位点来调节苯乙烯环氧化的对映选择性。在H₂O₂体系下，不添加Im-C6-Phe的对照组，F87A/T268V、F87G/T268V、F87V/T268V均无活性，而添加Im-C6-Phe后，其催化苯乙烯环氧化的活性大幅提升（表1、10-12行），充分表明DFSM可作为酸碱催化剂来协助活化利用H₂O₂，从而解除高度保守位点T268的限制。此外，结果表明T268V的叠加突变还进一步提升(R)-氧化苯乙烯的对映选择性（表1、10-12行）。因此在双功能小分子协同P450BM3-H₂O₂体系下，通过T268突变和其他位点的组合突变可提升苯乙烯环氧化的催化活性和R构型对映选择性。

于是在上述基础之上，进一步对F87/T268双突变体进行半理性设计(F87A/T268V、F87A/T268I、F87G/T268V、F87G/T268I、F87V/T268I和F87I/T268I)，结果显示（R）-氧化苯乙烯的对映选择性得到进一步提升（83% ee-97% ee），然后选定对映选择性最优的F87A/T268I为亲本酶进行底物空腔周围其他关键位点（图3A）的叠加突变，突变策略为将氨基酸突变成结构或极性存在典型差异的氨基酸。筛选结果显示，突变体F87A/T268I/L181Q可将（R）-氧化苯乙烯的对映选择性提升至99% ee（图3B），30 min TON为918。而且将筛选得到的有益突变进行组合，进一步获得F87A/T268I/V78A/A184L可将TON提升至4000以上，（R）-氧化苯乙烯对映选择性依然保持98% ee。

后续对获得的典型突变F87A/T268I/L181Q和F87A/T268I/V78A/A82V进行了半制备量反应。结果显示，（R）-氧化苯乙烯的对映选择性保持不变，分离产率分别达到43.8%和54.2%（表2）。

最后，作者将本研究策略体系拓展至苯乙烯衍生物的环氧化。结果显示其同样具有优异的不对称催化性能，（R）-氯代氧化苯乙烯的对映选择性均可实现95% ee-99% ee（图4），（R）-氟代氧化苯乙烯的对映选择性亦可达97% ee-99% ee（图4）。

本文利用P450酶的半理性设计和双功能小分子协同P450催化策略的有机结合，实现了苯乙烯及其衍生物不对称环氧化对映选择性的高效控制，(R)-氧化苯乙烯的对映选择性可达99% ee。本研究不仅显示双功能小分子协同P450过加氧酶催化策略在烯烃不对称环氧化方面的独特优势，同时也为P450酶催化能力的拓展提供了一条新途径。

中科院青岛生物能源与过程研究所赵盼霞、陈杰为该论文的共同作者，丛志奇为论文通讯作者。研究工作得到国家自然科学基金，青岛创新领军人才计划以及中国科学院生物燃料实验室等的支持。