摘要
多肽固相合成是20世纪有机合成化学最重要的突破之一，由布鲁斯·梅里菲尔德于1963年创立。该方法通过将氨基酸C端共价连接至不溶性固相载体，在载体上依次进行脱保护、偶联、洗涤等循环操作，最终从载体上切割得到目标多肽。本文系统阐述SPPS的基本原理、关键步骤、载体与保护基选择、常见偶联策略，并探讨其在药物发现、生物材料及化学生物学等前沿领域的应用。文章还分析当前技术挑战及未来发展方向。
1. 引言：固相合成的基本概念与优势
传统液相多肽合成面临分离纯化困难、收率低等挑战。SPPS的核心创新在于将多肽链锚定在固相载体上，使反应中间体始终与载体结合，过量试剂和副产物通过简单过滤即可去除。这种”过滤-洗涤”的循环操作模式，使多肽合成实现了自动化和高通量化。
关键优势：
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简化纯化：只需过滤洗涤，无需中间体分离
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驱动反应完全：可使用过量试剂提高偶联效率
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易于自动化：适合长肽（>50个氨基酸）合成
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兼容多种官能团：通过正交保护策略实现
2. SPPS的核心组件与流程
SPPS包含三个基本要素：固相载体、保护基策略、偶联试剂。其标准流程遵循Fmoc/t-Bu或Boc/Bzl策略，下图为Fmoc策略的详细合成循环：
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树脂类型：
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聚苯乙烯树脂（PS）：最常用，溶胀性好
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聚乙二醇接枝树脂（PEG-PS）：亲水性好，适合难溶序列
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聚丙烯酰胺树脂：高度亲水
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连接臂：决定了最终的切割方式和C端功能基团。常见类型包括：
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Wang树脂：产生游离羧酸
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Rink酰胺树脂：产生C端酰胺
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安全连接臂：防止提前切割
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2.2 保护基策略
Fmoc/t-Bu策略（当前主流）：
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α-氨基保护：Fmoc（9-芴甲氧羰基），在温和碱性条件下（20%哌啶/DMF）脱除
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侧链保护：t-Bu、Boc、Pbf、Trt等，在强酸（TFA）条件下脱除
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正交性：Fmoc（碱脱）与侧链保护基（酸脱）完全正交
Boc/Bzl策略（历史重要）：
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使用TFA脱除Boc，HF最终切割
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适合合成复杂多肽，但操作危险性较高
3. 偶联化学：效率与消旋控制
氨基酸偶联是SPPS最关键的步骤，涉及羧基活化形成高活性的中间体。
3.1 常用偶联试剂
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碳二亚胺类：DIC、DCC（常与HOBt联用减少消旋）
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鎓盐类：HBTU、HATU、HCTU（高效，消旋少）
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磷酸鎓/脲鎓盐：PyBOP、PyAOP
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预活化形式：OAt、OPfp酯
3.2 减少消旋的策略
消旋主要发生在活化步骤，通过形成恶唑酮中间体。
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添加HOBt、HOAt等添加剂
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使用低极性溶剂（如DMF/CH₂Cl₂混合）
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控制反应温度（0-4°C进行活化）
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选择合适偶联试剂（如HATU消旋率低）
3.3 困难序列的应对
某些序列（如富含Val、Ile、Ser的聚集倾向序列）偶联效率低：
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增强活化：使用HATU/HOAt/DIPEA组合
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双偶联策略：重复偶联步骤
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微波辅助：提高反应速率和效率
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主链修饰：插入伪脯氨酸或Dmb保护基
4. 监控与分析方法
4.1 实时监控
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茚三酮测试：监测游离氨基，蓝色为阳性
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氯醌测试：对茚三酮不敏感的二级胺
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溴酚蓝测试：定性检测氨基
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在线光谱法：红外、拉曼监测反应进程
4.2 切割后分析
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HPLC：分析纯度与保留时间
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质谱（MALDI-TOF/ESI-MS）：确认分子量
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氨基酸分析：定量测定组成
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圆二色谱：分析二级结构
5. 现代应用与扩展
5.1 肽类药物开发
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胰岛素类似物、GLP-1受体激动剂（如利拉鲁肽）
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抗菌肽、抗癌肽
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多肽疫苗抗原合成
5.2 复杂肽类合成
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环肽：头尾环化、侧链环化
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糖肽/磷肽：引入翻译后修饰
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双功能肽：引入荧光标记、生物素等
5.3 组合化学与文库构建
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混合裂分法：一珠一化合物文库
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平行合成：96孔板格式的高通量合成
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DNA编码文库：连接多肽与编码DNA标签
5.4 蛋白质化学合成
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天然化学连接：通过NCL连接未保护肽段
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KAHA连接：α-酮酸-羟胺连接
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合成蛋白质：合成含非天然氨基酸的蛋白质
6. 技术挑战与解决方案
6.1 合成长度限制
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问题：长肽合成累积效率低（>50个氨基酸）
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解决：片段缩合策略、优化偶联条件、改进树脂
6.2 疏水肽的合成与纯化
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问题：聚集、溶解性差
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解决：使用PEG树脂、添加助溶剂、优化切割配方
6.3 消旋与副产物
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问题：特别是Cys、His易消旋
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解决：优化保护策略、使用专用偶联试剂
7. 未来发展方向
7.1 自动化与智能化
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全自动合成仪：集成在线监测与反馈控制
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AI优化合成条件：机器学习预测最佳偶联策略
7.2 绿色合成
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减少溶剂使用：流动化学、微波辅助
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环保溶剂：替代DMF、NMP等有害溶剂
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可回收试剂与载体
7.3 新偶联化学
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无消旋偶联：开发新型活化机制
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光催化偶联：时空控制的多肽延伸
7.4 集成化平台
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合成-分析-纯化一体化：在线HPLC/MS监控与自动纯化
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微流控芯片合成：皮摩尔级多肽合成
8. 结论
多肽固相合成历经60年发展，已从实验室方法转变为生物医药研究与开发的核心平台技术。随着新型载体、保护基、偶联试剂的不断发展，以及自动化、人工智能技术的融合，SPPS正朝着更长、更复杂、更精准、更绿色的方向发展。其在肽类药物、化学生物学工具、生物材料等领域的应用边界不断拓展，持续推动着生命科学和医学研究的进步。
未来SPPS的发展将不仅局限于肽链的组装，更将致力于与生物学功能的高效整合，实现从序列到功能的直接对接，为精准医学和合成生物学提供强大的化学基础。
