Cell Chem. Biol. | 基于孔板的高通量活性半胱氨酸分析

分享一篇发表在Cell Chem Biol上的文章：Accelerating multiplexed profiling of protein-ligand interactions: High-throughput plate-based reactive cysteine profiling with minimal input，通讯作者是哈佛医学院的Steven Gygi教授及他们课题组的博士后余庆，其中Gygi教授是蛋白质谱领域的权威。这篇文章中作者对SLC-ABPP的流程进行了改进，降低蛋白用量的同时提高了半胱氨酸鉴定数目。

isoTOP-ABPP技术是大规模筛选蛋白共价配体的高效手段，通过结合TMT多重定量标签，2021年开发的SLC-ABPP技术已经成功实现了11个样品的同时检测，并将蛋白的需求量减少到了50-100μg。但由于SLC-ABPP需求的蛋白量对于96孔板的大规模筛选体系来说仍然过多，并且过大的蛋白量也导致了更多的TMT试剂用量，此外，SLC-ABPP中半胱氨酸的鉴定数目只有8000个。本文作者希望能够整合近年来蛋白质组学技术上的多种革新，从而开发一套新的TMT-ABPP流程。

作者在SLC-ABPP的基础上做了三项改进，(1)使用18plex TMTpro试剂以提高同一组中的样品数目；(2)使用SP3磁珠来简化样品制备流程；(3)相比SLC-ABPP中的磁珠具有10倍载量的streptavidin-agarose beads；(4)高场不对称波形离子迁移质谱(FAIMS)。在新的流程中，细胞在裂解并经过DBIA标记后，后续的还原烷基化、酶切以及TMT标记步骤均可在96孔板上完成，通过SP3磁珠来除去多余的试剂，最后经过合并除盐以及富集后经过LC-FAIMS-MS/MS鉴定。

作者发现使用新的流程可以在10μg用量的293T蛋白中经过一针质谱定量到约18000个半胱氨酸位点，将蛋白量提高到20μg则能够将一针的鉴定数目进一步提高到24000，相比SLC-ABPP而言蛋白量降低了5-10倍，同时半胱氨酸位点鉴定数目提高了2-3倍。作者进一步用新的流程对192个共价配体的结合靶点进行了大规模分析，一共鉴定到了38450个半胱氨酸位点。对鉴定到的位点以及AlphaFold2预测的蛋白结构进行比对分析后他们发现，一些亲电性配体对某些蛋白结构域具有一定偏好性，他们找到了一些倾向于结合激酶结构域、硫氧还蛋白结构域的配体。此外，他们也发现了一些此前未被报道过的共价药物的脱靶效应，包括THZ1，ARS-1620，Sulfopin，DMF，ibrutinib。

总之，这篇文章对SLC-ABPP的流程进行了改进，在降低5-10倍蛋白用量的同时提高了2-3倍的半胱氨酸鉴定数目。

本文作者：LDY

责任编辑：WFZ

原文链接：
https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(23)00429-4#%20

文章引用：10.1016/j.chembiol.2023.11.015