研究蛋白质相互作用（PPI）对于揭示靶蛋白的功能以及系统性地理解相关生物过程至关重要。传统的PPI研究方法如亲和质谱，需要裂解细胞，从而分离和鉴定互作蛋白。然而裂解细胞会干扰蛋白的亚细胞分布并稀释蛋白，可能会导致一些结合蛋白分离或者产生一些非天然的蛋白相互作用。而基因编码的具有潜在生物反应性的非天然氨基酸（Uaa）能够原位捕获活细胞中直接相互作用的蛋白质，并且通过鉴定Uaa介导的交联肽段来确定相互作用界面。但是由于蛋白样品的复杂性以及交联肽段较低的离子化效率，鉴定Uaa介导的交联肽段仍旧很有挑战性。即使肽段水平富集显著增加了检测的灵敏度，但是仍存在交联效率较低的问题，导致被鉴定的交联肽数量较少。后来，人们开发出了可富集的具有潜在生物反应性的Uaa EB3，并在活细胞模型蛋白中成功验证，但是这种Uaa只能与蛋白组中丰度较低的半胱氨酸反应，仍然无法很好地满足需求。最终，具有多种氨基酸反应性、交联效率较高并且可富集的氟硫酸盐-L-酪氨酸（FSY）被开发出来，这种Uaa对Lys、His以及Tyr侧链基团都具有反应性，在体外和活细胞中都具有很高的交联效率，但是FSY的脱靶效应和交联产物还没有经过质谱验证。

基于上述背景，作者在FSY的基础上，结合了MS可裂解小分子交联剂以及化学裂解交联Uaa的特点，设计出了一种从未被报道过的MS可裂解化学交联Uaa（MSCXUaa）。MSCXUaa具有以下优点：首先，与小分子交联剂相比，MSCXUaa可以进入活细胞中在生理条件下原位交联，而不用杀死细胞，能够避免对原有蛋白相互作用的干扰。其次，相较于化学裂解的光交联Uaa，MSCXUaa能够在一级质谱中保持交联肽段的完整性，增加交联肽段鉴定的特异性。最后，质谱可裂解的交联肽段相较于不可裂解的交联肽段具有更高的离子化效率，可以在二级质谱中产生更多包含交联位点的碎片离子，进而提高交联肽段的碎片离子覆盖率。

作者首先尝试通过遗传密码子拓展技术在大肠杆菌中表达基因编码的MSCXUaa。作者通过五步合成得到了MSCXUaa并命名为eFSY（如图1a所示），并将氨酰tRNA合成酶chPheRS-1的氨基酸结合口袋进行了改造以匹配eFSY的结合。作者将190位含有TAG密码子的带有His标签的EGFP与chPheRS-1的不同突变体共表达，然后通过His标签纯化结合凝胶电泳以及高分辨电喷雾电离飞行时间质谱分析筛选出了能够识别eFSY的突变体（V393G，F464C），并命名为eFSYRS。为了验证eFSY的成功插入，作者将24位为TAG密码子的带有MBP与His标签的Z蛋白与eFSYRS在DH10B中共表达，并通过完整蛋白质谱以及Glu-C酶切肽段串级质谱分析证实eFSY成功插入到了MBP-Z的24号位点（如图1b-f所示）。

已知FSY能够与His、Tyr以及Lys侧链基团交联，为了测试eFSY的交联能力，作者将MBP-Z（E24eFSY）与不同亲和突变体（7Ala，7Lys，7His，7Tyr）共孵育。WB和串级质谱证明了eFSY能够与His、Tyr和Lys产生交联。通过在eFSY位点引入生物素标签并用单亲和微球进行富集，交联肽段的富集度增加了十倍，验证了eFSY可富集的特点（如图1g-l所示）。

作者在分析质谱数据时发现eFSY与His、Lys产生的交联是质谱可裂解的，与Tyr产生的交联是质谱不可裂解的，而在可裂解的交联中还包括交联键断裂与交联基团内部碎裂两种碎裂模式（如图2f-i，3a-b所示）。由于目前没有能够完美分析这种交联质谱数据的软件，作者开发出了一个能够考虑到文中所有形式的碎片离子的搜索引擎AixUaa。AixUaa运行的基本逻辑如图3c所示。为了评估AixUaa鉴定Uaa介导的MS可裂解的交联质谱数据的能力，作者构建了四个模拟的U-H/K交联数据库Sim1-4，并将AixUaa与现有搜索引擎进行对比，结果表明相较于现有的数据库搜索引擎，AixUaa展示出了更高的鉴定精度。作者又将AixUaa用于分析硫氧化还原蛋白富集样品，如图3d-e所示，AixUaa鉴定出了更多的U-H/K交联位点，总的交联肽段鉴定数为391，对应184个蛋白。从图3f中可以看出，鉴定到的交联位点主要为Lys，这可能与Lys在细胞中的较高丰度有关。