分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，题目为“Peptidic Probes to Capture Enzyme Activity Using Novel Solid Phase Compatible Warheads”。文章的通讯作者为都柏林圣三一学院的Joanna F. McGouran，其研究方向为基于活性的蛋白质分析（ABPP）。
泛素化是一种关键的翻译后修饰，通常被视为蛋白降解信号。作为由76个氨基酸残基组成的蛋白，泛素通过其C-端羧基与被修饰蛋白侧链的Lys形成异肽键，从而产生泛素化修饰；此外，泛素本身的7个Lys位点也可被另一分子泛素以相同的方式修饰，形成具有丰富分支结构的多聚泛素化修饰。去泛素化酶（DUBs）通过切割异肽键调节泛素化水平，人类基因组编码约100种DUBs，其中有6种为半胱氨酸蛋白酶。本文所关注的OTUB1即为一种典型的半胱氨酸蛋白酶类DUB，结构上，其底物结合界面可容纳泛素链上两个连续的泛素分子，通过典型的催化三联体选择性切割K48连接的泛素链。
OTUB1的上述性质使其自然地成为了ABPP的理想靶标，事实上，靶向半胱氨酸蛋白酶类DUBs的基于活性的探针（ABP）早在ABPP技术发展早期就已被开发：通过在泛素分子N端连接报告基团、C-端连接半胱氨酸反应性的共价弹头（例如乙烯基甲酯（VME）和端炔），即可得到靶向全体DUBs的ABP（EMBO J. 2001;20(18):5187-96）。为了实现对特定DUB的选择性，人们也开发了相应的嵌合探针：两个泛素分子通过特定的架构（如K48）相连，而反应基团则位于两个泛素分子的连接处，作为“诱饵”与识别特定泛素链架构的DUB共价反应（Chem Biol. 2013;20(12):1447-55）。然而，上述范式中的ABPs通常由蛋白半合成得到，历经多步修饰和纯化，灵活性差且产量很低。本文中，作者设想，能否利用一种最简化的多肽序列实现对OTUB1的选择性识别和标记？
由于OTUB1选择性识别K48连接的泛素链，容易想见，与“近端（proximal）”（提供C-端的）泛素分子相比，“远端（distal）”（提供K48的）泛素分子形成的结合界面对这种选择性识别的贡献更大。因此，作者截取了泛素的G35～L50或A46～D60作为OTUB1特异性识别序列，它们都包含了提供侧链氨基的K48位点。在K48位点处，作者引入了前述两种半胱氨酸反应性基团；在N端则引入了生物素报告基团。在合成侧链带有共价弹头的UAA后，如此设计的多肽探针易于通过标准的SPPS方法合成。
得到这些共价多肽探针后，作者在纯化的OTUB1蛋白上测试了它们的标记能力，并在细胞裂解物中确认了它们对OTUB1的优异选择性。其中，以Ub A46～D60作为识别骨架、以VME作为共价弹头的探针19能够在HCT116 细胞裂解物中特异、灵敏地标记内源的OTUB1。综上所述，作者巧妙地利用了OTUB1对K48连接的多肽链的选择性，开发了一种基于多肽的OTUB1共价探针，在不牺牲特异性的前提下克服了传统蛋白探针合成困难的弊端。
本文作者：TYC
责任编辑：WYQ
DOI：10.1021/acschembio.5c00771
原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00771
