推荐一篇发表在Acta Pharmaceutica Sinica B上的文章，其标题为“mRNA display-enabled discovery of proximity-triggered covalent peptide–drug conjugates”。本文通讯作者是中国医学科学院北京协和医学院药物研究所的王锐院士和罗惠鑫研究员。王锐院士长期致力于多肽药物的创制与产业化研究‌，罗惠鑫研究员现为药物所王锐院士团队骨干之一，主要专注多肽/蛋白类药物的开发。本文中，作者通过将邻近驱动连接技术与大环化合物文库筛选策略相结合，设计并构建了一种新型mRNA展示平台，实现了特异性靶向目的蛋白Nectin-4的共价多肽-药物偶联物，实现肿瘤细胞的精确杀伤。

多肽-药物偶联物（PDCs）能够在实现靶向药物递送的同时，精准且稳定地结合药物靶点，而受到精准肿瘤学领域的广泛关注。此前的研究中，共价多肽筛选策略依赖于翻译后弹头偶联，因而其筛选通量和结构多样性受到了限制。

为了解决这一问题，本文中，作者试图将基于SuFEx的邻近驱动连接技术与mRNA展示策略相结合。近年来，SuFEx点击化学反应为共价药物设计与开发提供了新的设计思路，其具有邻近驱动生物活性的硫酰氟反应基团可以靶向酪氨酸、组氨酸和赖氨酸等天然氨基酸的亲核残基，是更为理想的亲电共价弹头。研究者通过柔性体外翻译系统（FIT），在长度为8至12个NNK简并密码子的mRNA展示文库中随机地引入了带有硫酰氟基团的非天然氨基酸FSY。同时，在起始位置引入的带有氯乙酰基侧链的非天然氨基酸，并与文库C末端的半胱氨酸进行反应，从而构建了含有磺酰共价弹头的高通量共价大环肽mRNA展示文库。后续，文库与靶标蛋白共价结合后，通过亲和富集纯化靶标结合的文库，并通过强洗涤条件去除非共价结合的组分，从而实现靶向共价大环肽的有效筛选。经过多轮次筛选放大后，可以利用高通量二代测序（NGS）鉴定富集到的多肽序列，并通过固相多肽合成（SPPS）技术结合“保护-脱保护”策略实现含有磺酰氟结构的共价大环肽的合成。

基于此，研究者以黏连蛋白Nectin-4的胞外区（ECD）结构域为靶标，进行了共价环肽的筛选。Nectin-4是一种与多种恶性肿瘤发生发展相关的关键蛋白，是多种肿瘤治疗的重要靶点。研究者通过六轮共价大环肽筛选，发现了一个结合的共享保守序列基序“fXNAFPVRxLxxWC”，其中“f”代表D-苯丙氨酸，”X”代表 FSY，”x”代表可变残基。通过生物正交衍生以及基于SPR的结合能力分析，他们确定带有叠氮基团的CP-N1-N3（Ki=3.58 μmol/L）和CP-N9-N3（Ki=4.94 μmol/L）为最优成员。研究者通过胶内荧光检测，确定了CP-N1-N3和CP-N9-N3均能与Nectin-4产生高效且高特异性的共价结合（与Nectin-4的标记效果是其他Nectin家族蛋白的约6倍）。并且，研究者也通过免疫荧光的检测手段，确定了二者能与Nectin-4高表达的MDA-MB-468细胞实现共价结合。因此，研究者以CP-N1-N3和CP-N9-N3二者的结构为基础进行后续的应用拓展。

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通过一系列生化与成像验证，研究者确认此两种共价环肽分子在纯蛋白与活细胞层面的标记能力。后续通过叠氮基团连接了抗有丝分裂抑制剂MMAE，他们成功实现了肿瘤细胞的高效杀伤（IC50 = 43.45 ± 4.00 nmol/L）。作者在后续的机理验证中确认CP-N1-MMAE会与细胞表面的Nectin-4分子共价结合后，经内吞作用进入内体-溶酶体途径，并被组织蛋白酶*（CTSB）特异切割连接子并释放药物载荷MMAE，诱发靶细胞凋亡，从而达到细胞杀伤的效果。考虑到CP-N1-MMAE在小鼠血清中优秀的稳定性（t1/2= 4.41 h），研究者确认CP-N1-MMAE为最有潜力的共价多肽-药物分子，为后续肿瘤治疗与靶向提供了重要支持。

综上，本文中，作者设计并构建了一种结合mRNA展示与环肽设计的共价多肽-药物筛选平台，并成功开发了一种精准靶向Nectin-4的共价多肽药物偶联物CP-N1-MMAE，为后续肿瘤治疗与共价多肽-药物设计与开发提供了新角度新技术，具有重要意义。

罗惠鑫课题组长期招聘博士后及科研助理，有意者请联系 luohuixin@imm.ac.cn。

本文作者：KLH

责任编辑：ZF

DOI：10.1016/j.apsb.2025.07.029