分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，题目为“Novel Urazole-Derived MS-Cleavable Cross-Linkers Targeting Tyrosine/Lysine Residues for Protein Structural Analysis”，通讯作者是来自吉林大学的魏忠林教授，和中国计量科学研究院的李明教授。魏忠林教授研究方向是生物偶联化学，李明教授则是专注于蛋白质质谱分析和化学交联技术的开发。在本文中，作者发展了一种靶向酪氨酸和赖氨酸的MS可切割交联剂，用于蛋白结构的解析。

化学交联质谱（XL-MS）是研究蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的一种技术。因为胺反应性的有效性以及赖氨酸在蛋白质和PPI界面中的高丰度，目前，赖氨酸交联剂是使用最广泛的试剂，而关键功能区酪氨酸（占3.2%）因反应活性低、位点深埋，长期缺乏有效捕获工具。因此，为了补充化学交联质谱的工具，在本文中作者开发了两种靶向酪氨酸和赖氨酸的MS可切割化学交联剂，用于蛋白质复合物结构的解析。

首先，作者设计了一种同型双功能交联剂SBT，该交联剂通过电化学氧化激活尿唑基团，进而与酪氨酸特异性结合。此外，交联剂中引入亚砜linker，以实现在质谱中的断裂；针对蛋白表面Tyr残基丰度较低的问题，作者将SBT其中一侧的尿唑换成NHS来靶向赖氨酸，得到异形交联剂SCT，提升了交联效率来得到更多的交联信息。

作者用含有酪氨酸的血管紧张素肽来对两种交联剂的活性进行检测，在二级谱图中确定了肽段中酪氨酸残基与交联剂的单端连接产物，而且交联剂的碎裂模式也和预期一致，分别生成烯硫醇和烯烃；然后通过延长反应时间，也检测到了血管紧张素肽之间的交联。

在肽段之后，作者还在谷胱甘肽s-转移酶（GST）、抗PSMD 10多克隆抗体 、牛血清白蛋白（BSA）等蛋白中检测交联剂的活性。其中BSA的结构较为复杂，文中创新性地用胰蛋白酶和胃蛋白酶联合应用，胃蛋白酶消化特别增强了对富含酪氨酸区域的检测，将有效交联鉴定提高了63%。

​

此外，作者还利用AlphaFold3.0生成了5个BSA的能量最小化模型，其中模型1与BSA的晶体结构信息差异最大，且与SBT、SCT的交联数据一致性最高，75%的交联位点与预测一致，而且远距离交联的数量也得到减少，因此作者得出BSA结构可能主要以模型I的存在于溶液中的结论。

总的来说，作者首次报道了靶向酪氨酸残基的MS可切割交联剂，增强了XL-MS分析破译蛋白质复合物结构的能力。

本文作者：YDH

责任编辑：TZS

DOI：10.1021/acs.analchem.5c01695

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c01695