Angew. Chem. ：通过高通量计算提升双结构域淀粉酶的冷适应性

冷适性酶能在0–25°C低温下保持高活性，广泛应用于洗涤、纺织、食品加工和环境修复等行业，具有显著的节能减排潜力。尽管市场规模庞大，其在许多工业领域的应用仍受限，主要因为缺乏有效的工程方法来提升酶的冷适性。双结构域酶，如常见的淀粉酶，在酶类中占比较高。但由于其结构复杂，结构域间的相互作用和连接肽链的影响，使得传统基于单结构域酶柔性的工程策略难以奏效。同时，其结构难以解析，进一步限制了冷适性机制的研究和相关设计。因此，开发适用于双结构域酶冷适性工程的策略具有重要的科学意义和应用前景。

范德堡大学杨中悦教授团队的丁宁博士和姜姚昱坤博士开发了一种计算与实验相结合，用于提升双结构域酶的冷适性的策略。双结构域淀粉酶可进一步分为催化结构域（catalytic domain, CD），碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module, CBM）及连接肽（linker）三部分。以Pseudomonas saccharophila 淀粉酶（psA）和 Saccharophagus degradans 淀粉酶（sdA）为模型体系，作者发现冷适性酶相比于常温型酶具有更大的结构域分离程度。基于此，作者提出了“结构域分离指数（DSI）”这一定量指标，用以描述双结构域体系中的结构域分离程度。

作者进一步基于DSI开展了高通量计算筛选（使用了作者团队先前开发的EnzyHTP软件包），对120个具有不同连接肽的psA变体进行分析，预测psA121具有最大结构域分离，因而最有可能在低温下展现出较高活性。实验验证显示，psA121在0°C的相对活性提升了3倍，从9.2%（水解活性34.7 U/mg）提高至26.7%（94.0 U/mg）。

作者指出，能够诱导冷适性的连接肽不仅有助于结构域分离，还可能增强CD与CBM中功能性环的柔性。在psA121中，活性位点环呈现出开放与闭合构象之间的动态平衡，而psA则主要维持在开放状态。开放构象有利于体积较大的多糖底物顺利进入CD的活性位点，而闭合构象则可增强底物结合能力与催化效率。此外，CBM中的柔性结合环可加速聚集的多糖链分离，沿单条多糖链滑动以促进CD的底物结合和产物释放。CD与CBM中功能环柔性的协同提升，是淀粉酶冷适性增强的关键因素之一。

作者对120个变体的统计分析进一步揭示了连接肽中的螺旋二级结构在促进结构域分离中的重要性。DSI分布的相似性表明序列长度对结构域分离程度的影响较小。相较之下，螺旋结构的存在与否则显著影响结构域间的分离程度。螺旋结构可作为“垫片”，有效增加CD与CBM之间的距离，从而促进冷适性。

该工作不仅提出了工程化冷适性双结构域酶的实用策略，也阐明了双结构域淀粉酶冷适性的分子机制，为酶的理性设计与绿色工业生物过程的可持续发展提供了理论基础与技术路径。

论文信息

Enhancing Cold Adaptation of Bidomain Amylases by High-Throughput Computational Engineering

Ning Ding, Yaoyukun Jiang, Robbie Ge, Qianzhen Shao, Wook Shin, Xinchun Ran, Zhongyue J. Yang

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202505991