分享一篇发表在Angewandte Chemie上的文章，文章标题是“Tuning Encodable Tetrazine Chemistry for Site-Specific Protein Bioorthogonal Ligations”，通讯作者是来自俄勒冈州立大学生物化学和生物物理学系的Ryan A. Mehl副教授，他的主要研究方向是遗传密码子扩展技术的开发和应用。

生物正交化学（Bioorthogonal Chemistry）是指能够在生物体系中进行而不干扰生物自身化学过程的化学反应。这种技术在蛋白质标记、药物递送和生物成像等领域具有重要应用。近年来，遗传密码子扩展技术的出现为生物正交化学提供了新的可能性。通过遗传密码子扩展技术，可以将非天然氨基酸（ncAA）插入到蛋白质中，从而实现对蛋白质的特异性修饰和标记。然而，传统的生物正交连接化学反应速率较慢，无法满足生理相关蛋白质浓度或细胞内蛋白质标记的需求。四嗪（Tetrazine, Tet）与反式环辛烯（TCO）之间的逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应因其快速的反应速率而受到关注。这种反应速率可以达到102-106M-1S-1，远高于传统的生物正交反应。作者希望能够通过遗传密码子扩展技术，将含有四嗪基团的非天然氨基酸插入蛋白质中，用于后续实现快速的生物正交连接。

作者首先依据结构将Tet-ncAA分为Tet1-Tet4四类，并合成了这四类共计31种非天然氨基酸。随后作者将Tet-ncAA插入sfGFP的Asn150位点，并结合已有的Tet-ncAA表达系统在细菌中表达。通过检测荧光的产生并使用MS辅助评估不同种类Tet-ncAA的插入效率。结果显示Tet2-ncAA烷基衍生物编码效率高，但芳香基衍生物几乎无法编码。Tet3-ncAA烷基和芳香基衍生物均能编码，但芳香基衍生物的编码效率较低；Tet4-ncAA芳基衍生物编码效率高，而吡啶基衍生物虽反应速率快，但在蛋白质中稳定性较差。

随后作者检测了Tet-ncAA在插入蛋白后的反应效率和反应速度。对于反应效率，作者使用了mass-tag策略，将纯化的Tet-sfGFP150与5k-PEG-TCO反应后经凝胶电泳分离检测click的反应效率。结果显示绝大多数的Tet-ncAA在蛋白质上都能够高效地与TCO反应。在这些Tet-ncAA中，氟代苯基取代的ncAA反应速率最快，Tet4-3F-Ph和Tet4-3,5-diF-Ph的反应速率分别达到62×104 M-1S-1和84×104 M-1S-1。此外，作者还检测了Tet-ncAA的稳定性。在4°C下，所有的Tet-ncAA在8天内保持稳定；但是在室温下，芳基衍生物会迅速降解。相比之下，氟代苯基衍生物在室温下8天后仍保持70%以上的反应性。

最后作者在293T细胞中表达了Tet-ncAA插入的sfGFP，并通过流式细胞术验证了其与细胞穿透性染料sTCO-JF646的反应性。结果显示，Tet4-3F-Ph在细胞内表现出相对较高的标记效率和一致性。作者基于Tet4-3F-Ph结构开发出了Tet4-3,5-diF-Ph和Tet4-3,4,5-triF-Ph，反应速率更高，而且在室温下表现出优异的稳定性。

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总之，作者系统研究了基于四嗪的非天然氨基酸Tet-ncAA的编码效率和与TCO的反应性，并开发出了两种反应速率较高的ncAA Tet4-3,5-diF-Ph和Tet4-3,4,5-triF-Ph，为生物正交化学领域提供了重要的工具。

本文作者：ZBY

责任编辑：TZS

DOI：10.1002/anie.202508922

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202508922