为了攻克这一技术瓶颈，浙江工业大学课题组利用其课题组挖掘得到的特殊腈水合酶——目前报道的唯一具有翻译后自修饰功能的钴型腈水合酶（Biotechnology Journal, 2021, DOI: 10.1002/biot.202100103），构建了包含173种信号肽的腈水合酶表达文库。同时，为了提高信号肽文库的筛选效率，课题组基于基于His6-M2+-NTA系统亲和相互作用的原理设计了一种新的荧光探针Rho-IDA-CoII，该荧光探针能体外特异性标记融合组氨酸标签的靶蛋白。利用新型荧光探针Rho-IDA-CoII和斑点印迹法，成功对腈水合酶信号肽文库的分泌表达效率进行了高通量筛选。

进一步，他们结合荧光探针Rho-IDA-CoII和斑点印迹法设计了高通量筛选方法，该方法能够对1 – 10 pmol范围内的组氨酸标签融合腈水合酶进行精准的蛋白定量（图c）。使用高通量筛选方法从库容为6500的腈水合酶信号肽文库中筛选得到能分泌表达腈水合酶的枯草芽孢杆菌重组子，测序确定信号肽phoB介导的腈水合酶分泌表达效率最高，其培养液上清中腈水合酶的催化活性最高为17.34 ± 0.16 U/mL，是腈水合酶首次在枯草芽孢杆菌中成功进行分泌表达（图d）。

新型荧光探针Rho-IDA-CoII的合成路线简单，可特异性定量检测样品中含量低至1 pmol的组氨酸标签融合蛋白，并将其应用于腈水合酶信号肽文库的高通量筛选，获得了能在胞外表达腈水合酶的重组枯草芽孢杆菌。课题组的研究提供了一种快速、简单的制备腈水合酶的途径，并为高通量筛选提供了一种替代方法，具有广阔的应用前景。