介绍的是最近在Journal of the American Chemical Society上报道的一篇标题为“Deubiquitinase-Targeting Chimeras Mediated Stabilization of Tumor Suppressive E3 Ligase Proteins as a Strategy for Cancer Therapy” 的文章。该文的通讯作者是美国西奈山伊坎医学院药理学系Jian Jin教授和哈佛大学医学院病理学系Wenyi Wei教授。本研究首次提出创新的PRO-DUBTAC（Protein Stabilizing deubiquitinase-targeting chimera）平台，通过稳定具有肿瘤抑制功能的E3泛素连接酶，开创了新型抗癌治疗方法。
靶向蛋白质降解技术（Targeted Protein Degradation，TPD）是一种新兴的疾病治疗手段。传统靶向蛋白降解技术（如PROTAC）可降解致病蛋白，但无法解决肿瘤抑制蛋白表达不足的问题。在一些癌症如肾癌和肺癌中，肿瘤抑制蛋白的功能丧失与癌症发生发展密切相关。Von Hippel-Lindau (VHL) 和 KEAP1 是两类关键的肿瘤抑制性E3泛素连接酶：VHL 通过降解缺氧诱导因子HIF-1α抑制肿瘤血管生成，其功能缺失与80%以上的肾透明细胞癌相关。KEAP1 调控抗氧化转录因子NRF2的蛋白酶体降解，维持细胞氧化还原平衡。KEAP1失活导致NRF2过度积累，促进肺癌等发展。
然而，在一些癌症的进展过程中，这些用于降解其他底物的E3连接酶也面临着自身被降解的困境，导致其抑癌能力降低。因此，通过外源干预使这些蛋白在细胞中的水平更加稳定是一种有潜力的治疗策略。尽管已经有研究人员通过去泛素酶靶向嵌合体（DUBTAC）可通过招募去泛素酶稳定靶蛋白，但其应用仍局限于少数蛋白（如CFTR），且尚未用于E3连接酶的稳定化。因此，在本工作中，作者团队致力于开发一种普适性平台，利用E3连接酶配体和胞内去泛素化酶选择性稳定VHL和KEAP1，恢复其抑癌功能。
具体而言，作者设计了双功能分子，一端以配体结合靶E3连接酶（VHL或KEAP1），另一端以配体结合去泛素酶OTUB1，通过连接子共价连接，形成三元复合物。OTUB1能够去除靶蛋白上的泛素链，阻断其蛋白酶体降解途径。他们通过在溶剂可及位点上安装连接子，并筛选连接子的结构和长度，共获得了12种VHL-DUBTAC和9种KEAP1-DUBTAC，分析了它们的对应功能。（图1A-B）
首先，作者团队以VHL配体VH032为例子尝试构建VHL-DUBTAC。在VH032的溶剂可及位点上构建连接子，再与OTUB1的配体MS5105相连。通过改变连接子长度设计了Cpd V1-V12等12个VHL-DUBTACs化合物。他们以免疫共沉淀实验和GST pull down实验证明了生物素化的VH032也可以稳定与VHL形成复合物。随后通过Western Blot筛选获得了两种在Hela细胞中能够上调VHL表达量并下调其降解底物HIF1α的分子，分别为MS4170和MS4172。以其作为后续进一步研究的对象。（图1C-I）
图1. 开发首创性VHL-OTUB1去泛素酶靶向嵌合体的流程和初步筛选结果。
接下来，作者在Hela细胞系上详细研究了VHL-DUBTACs的作用效果。实验结果表明，MS4170和MS4172在HeLa细胞中能够浓度依赖性地稳定VHL，且24小时处理效果最佳。且免疫共沉淀实验表明MS4170促进VHL-OTUB1相互作用以形成三元复合物。同时，敲低OTUB1基因或竞争性添加游离配体（VH032和MS5105）均阻断VHL稳定，表明其作用效果依赖于配体相互作用。RT-qPCR实验表明，VHL-DUBTACs处理后下调HIF-1α下游基因（GLUT1、VEGF、PKM2）。并能够抑制Hela细胞增殖速率和集落形成，有良好的治疗潜力。（图2）
图2. VHL-OTUB1去泛素化酶靶向嵌合体（DUBTACs）MS4170和MS4172靶向稳定细胞中的VHL肿瘤抑制蛋白并产生杀伤能力。
进一步地，作者团队以相同的方法构建了针对KEAP1的DUBTACs。他们选择乙酯化的KI696作为KEAP1的配体，命名为KEAP1-L-OEt。同样在其溶剂可及位点上连接生物素，通过pull down实验验证其与KEAP1的稳定结合。进一步地，通过优化连接子长度，9种KEAP1-DUBTACs被合成出来，命名为Cpd K1-9。Western Blot筛选结果表明Cpd K7（MS2157）有最好的诱导KEAP1上调和其降解底物NRF2下调的活性，以此化合物进行后续研究。（图3）
图3. 开发首创性KEAP1-OTUB1去泛素酶靶向嵌合体的流程和初步筛选结果。
最后，作者团队在H1299细胞系上详细研究了MS2157的作用活性。MS2157能够在不影响KEAP1基因水平的下，以浓度和时间依赖的特征上调KEAP1并降解NRF2。同样地，OTUB1敲低或添加竞争配体都能阻断KEAP1的稳定上调。MS2157作用后，细胞内与抗氧化相关的基因（NQO1、HO1、MRP1）水平下降，细胞内活性氧ROS水平升高并进一步抑制H1299细胞集落的形成和细胞增殖。表明MS2157具有一定的抑制肿瘤生长的潜力。（图4）
图4. MS2157这一DUBTAC在细胞内稳定KEAP1肿瘤抑制蛋白并诱导细胞内活性氧生成和细胞杀伤。
综上所述，作者团队开发PRO-DUBTAC 了平台，成功稳定VHL和KEAP1两种关键E3连接酶，拓展了DUBTAC技术的应用范围。该技术利用E3连接酶识别的降解决定子设计配体，可推广至其他含类似结构的肿瘤抑制性E3酶。为靶向稳定肿瘤抑制蛋白提供了新范式，未来可通过“降解决定子模拟”策略开发针对多种E3连接酶的PRO-DUBTAC，推动精准癌症治疗。
作者：DYH 审校：SYM
DOI: 10.1021/jacs.5c06306
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c06306
