分享一篇最近发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，Peptidyl Prolyl Isomerase A Modulates the Liquid−Liquid Phase Separation of Proline-Rich IDPs。这篇文章的通讯作者为德国马克斯普朗克多学科研究所的Markus Zweckstetter教授。
细胞中的无膜细胞器通常是由天然无序蛋白（IDP）介导的液液相分离（LLPS）形成的，并且异常的液-固相转变与神经毒性相关。目前越来越多的证据表明，分子伴侣在调节LLPS相关的IDP生物分子凝聚体中发挥着重要作用。例如，热休克伴侣蛋白HSP70和HSP27维持了肌萎缩侧索硬化(ALS)/额颞叶痴呆(FTD)相关蛋白TDP43和FUS形成的凝集体的流动性；蛋白质二硫键异构酶被证明可抑制LLPS，并调节阿尔茨海默病相关蛋白tau的聚集。因此，分子伴侣可能保护蛋白质在细胞凝聚物内避免错误折叠和致病性聚集。
肽基脯氨酰异构酶是一种重要的伴侣蛋白，它用于催化脯氨酸顺反构象转换，辅助新生氨基酸链折叠。除此之外，脯氨酰异构酶还与IDP的高级组装结构形成相关，但目前它对IDP LLPS的调节作用尚不清楚。事实上，脯氨酸在IDP中的含量要显著高于在结构蛋白中的含量，其在IDP中的丰度约在结构蛋白中的1.8倍，因此对于脯氨酸构象的调节极有可能带来对IDP性质的调节。肽基脯氨酰异构酶A (PPIA)是细胞中最丰富的脯氨酰异构酶，最近的研究发现，PPIA的相互作用组在参与生物分子凝聚的富含脯氨酸的IDR中富集，表明脯氨酰异构酶PPIA在调节生物分子凝聚体中可能具有重要的生物学意义。在本文中，作者提供了关于PPIA对富脯氨酸IDP的LLPS行为所起调节作用的分子见解。
图1. 脯氨酰异构酶PPIA调节富含脯氨酸IDP的LLPS示意图
作者首先用NMR研究了PPIA与PR20单残基分辨率下的相互作用（图2a），其中PR20是40个残基的脯氨酸-精氨酸二肽重复蛋白，它可以非常有效地与RNA形成LLPS液滴。并且PR二肽重复蛋白会在ALS/FTD患者脑中异常表达，进入细胞中的无膜区室，并改变凝聚体的性质，从而产生毒性。结果表明，PPIA与PR20具有较强的相互作用力，PPIA中的Arg55在这之中起到了重要的作用，同时Arg55也是PPIA的酶催化中心，当Arg55突变为Ala后，PPIA(R55A)结合底物能力与催化活力均下降。
接着，作者研究了PPIA对PR20与RNA复合形成的凝聚体的影响。100 μM PR20与0.2 mg/mL tRNA混合后可以形成LLPS液滴（图2b），相比于突变后的PPIA(R55A)，PPIA可以更有效地富集于LLPS液滴中（图2c），并且由于PPIA与PR20的结合，当PPIA三倍当量过量于PR20时，LLPS液滴完全消失；对于突变体PPIA(R55A)，五倍当量过量时LLPS液滴数量才有所减少（图2d、e）。这些结果表明，PPIA可以更有效地促使PR20/tRNA液滴的溶解。
图2. PPIA对PR20/RNA相分离体系的影响。a) 在PPIA和PPIA(R55A)中加入四当量PR20后1H−15N HSQC峰强度变化。 b) PR20/tRNA相分离液滴。c) PR20/tRNA液滴内PPIA的浓度。d) PPIA诱导PR20/tRNA液滴溶解。e) 在加入PPIA15 min后，PR20/tRNA液滴所占体积的变化。
作者猜测PR20/tRNA液滴溶解的原因是PPIA催化了液滴中脯氨酸顺反异构的速率，从而改变了液滴的性质。因此，作者用NOESY和ROESY研究了PPIA催化脯氨酸残基顺反异构化的能力，而NOESY和ROESY是表征脯氨酸残基双态变化的有力工具。结果表明，在不含RNA的情况下，加入PPIA后，PR20中脯氨酸顺反异构的速率大大增加，并且交换速率随PPIA浓度增加而增加；而突变体PPIA(R55A)催化活力远低于野生型PPIA。
接着，作者进一步探究了PPIA是否能够调节阿尔茨海默病相关蛋白tau的LLPS，其中tau蛋白可以自发形成LLPS液滴，并且含有大量的脯氨酸残基。结果表明，尽管PPIA与PPIA(R55A)对tau的结合能力均比较弱，但是野生型PPIA可以有效地使tau液滴溶解（图3），这种调节作用表明，脯氨酰异构化对PPIA介导的tau液滴溶解有显著的贡献。
图3. PPIA调节tau蛋白的LLPS。a) tau蛋白结构域布局。b) tau蛋白与野生型和突变型PPIA的结合，在PPIA（蓝色）和PPIA(R55A)（红色）中加入10当量tau后1H−15N HSQC峰强度变化。c) tau的LLPS。d) tau液滴内PPIA的浓度。e) PPIA诱导tau液滴的溶解。f) 在加入PPIA5 min后，tau液滴所占体积的变化。
总的来说，本文的研究工作确立了脯氨酸异构酶对富含脯氨酸IDP的液相-液相分离的调节作用，脯氨酰异构化会导致相分离液滴性质产生变化。因此，作者认为，未来用小分子药物来靶向脯氨酰异构酶可能是一种调节疾病相关的生物分子凝聚体的可行策略。
作者：ZHS 审校：ZRC
DOI: 10.1021/jacs.2c07149
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.2c07149
