分享一篇发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry上的文章，题目是“Mass Spectrometry-Driven Epitope Mapping: Application of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling for the Immunotherapeutic Target Programmed Cell Death Protein 11”，文章的通讯作者是泰国朱拉隆功大学的Patanachai K. Limpikirati教授。
单克隆抗体（mAb）在治疗包括癌症在内的各种疾病方面显示出巨大的前景。其中，抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1）单克隆抗体已成为癌症免疫治疗的关键，是目前是最畅销的癌症药物之一。开发新型和生物仿制药抗PD1单克隆抗体对于提高其疗效、可用性和可负担性、使公共卫生系统和患者受益至关重要。表位识别（epitope mapping） 是确认抗体与抗原的结合位点、评估药效与免疫原性的关键步骤，对于证明表位新颖性、评估结合特性和预测免疫原性非常重要。
表位图谱可以通过 X 射线晶体学或是冷冻电子显微镜（Cryo-EM）等传统的高分辨结构技术来完成，但是X射线晶体学通常成本较高且周期长，Cryo-EM所需样本量较大且设备较为昂贵。与此同时，结构质谱技术也是一种分析蛋白结合表位的强大技术，目前常用的标记技术包括氢氘交换（HDX）、交联和共价标记（CL）等。二乙基焦碳酸酯（DEPC）共价标记-质谱（CL-MS）技术可以选择性标记亲核残基（His, Lys, Ser, Thr, Tyr）的N端，具有标记稳定、结果易解读、样品需求低和周期短的优点，目前已在TNF-α等蛋白上进行验证，该研究首次将其扩展至PD-1，目的是建立并优化一种用于PD-1表位识别的DEPC CL-MS方法。
作者识别并比较了两种抗PD-1抗体（nivolumab和新型抗体CU-MAB）与PD-1的结合位点。作者首先展示了PD1的序列覆盖率和DEPC标记结构覆盖率（图1）。PD1是一种由154个氨基酸组成的重组蛋白，分子量约为17.4 kDa，具有17个胰蛋白酶和24个胰凝乳蛋白酶识别位点，能够促进高效的蛋白水解消化。此外，它还含有 30 个 DEPC 可修饰氨基酸（不包括组氨酸标签序列），能够覆盖大部分蛋白质结构，非常适合使用DEPC CL-MS 实现结构解析。而在实验中发现，通过bottom-up的方法，PD1实现了约86%至90%的序列覆盖率（154个氨基酸中的132至139个），DEPC标记产生了约9%至16%的结构覆盖率（154个氨基酸中的14至25个氨基酸），表明该方法的可行性。
图1 PD1的序列覆盖率（黄色）和DEPC标记结构覆盖率（绿色球体）（PDB ID：3RRQ)，在存在（a）W6/32、抗人白细胞抗原 mAb（非结合性 mAb）、（b）nivolumab 和（c）CU-MAB（抗 PD1 mAb）的情况下。大约86%至90%的序列覆盖率代表一系列合并的序列覆盖率，每个序列覆盖率都是根据每组（PD1/nivolumab复合物、PD1/CU-MAB复合物或PD1和W6/32 mAb）中的所有重复计算得出的。
作者在存在和不存在nivolumab的情况下分析PD1的DEPC修饰水平，以识别抗体结合时的结合位点和构象变化。在两种状态之间，观察到25种标记氨基酸中的16个氨基酸的修饰水平发生显著变化（图2a），S27、T51、S57、S62、K78、S87、K135、H155/S159和H168/H169的标记增加，而T36、T53、S60、T76、H107、K131和S157的标记减少。这些变化表明nivolumab结合后表面可及性或局部微环境发生了变化。为了验证这些发现，作者将 DEPC CL-MS 结果与先前报道的与nivolumab结合的 PD1 表位进行了比较。S27、S60、S62 和 K131 与报道的表位一致。此外，位于晶体结构中T59和S60附近的S62也显示出%CL的显著变化，表明它们参与了表位-旁位相互作用（图2b）。
图2 与nivolumab结合的PD1的DEPC CL-MS表位图谱（PDB ID：5WT9)。（a）与nivolumab结合时PD1残基的DEPC修饰水平（%CL）的变化。红色星形表示标记增加的残基，蓝色星形表示标记性降低的残基。使用 p < 0.10 的 t 检验确定统计显著性。（b）与nivolumab结合的PD1（绿色）的结构表示（青色和淡青色），突出显示了DEPC CL-MS鉴定的表位和非表位残基。红色球体表示%CL增加的残基，蓝色球体表示%CL降低的残基。
同样地，作者分析了在存在和不存在CU-MAB的情况下PD1的DEPC修饰水平，在 S127 处注意到标记增加，而在 S27 和 K131 处观察到减少（图3a）。为了评估这些发现，作者将DEPC CL-MS结果与AlphaFold预测的表位进行了比较。N-、BC- 和 FG 环，以及 PD1 的 C 和 C’ 链，对于 CU-MAB 结合至关重要。值得注意的是，残基 S27、S127 和 K131 在%CL中表现出显著变化，与这些关键区域一致，表明它们可能参与表位-旁位相互作用（图3b)。残基S127处%CL的增加表明PD1/CU-MAB结合界面处存在更疏水的微环境。相反，残基 S27 和 K131 处%CL的减少表明这些残基受到保护，免受标记，这可能是由于与 CU-MAB 的直接相互作用导致的。这些发现突出了 CU-MAB 与PD-1相互作用时的结合区域，为进一步的功能研究和治疗开发提供了潜在的靶点。
图3 与 CU-MAB 结合的 PD1 的 DEPC CL-MS 表位图谱。（a）与CU-MAB结合时PD1残基的DEPC修饰水平（%CL）的变化。红色星形表示标记增加的残基，蓝色星形表示标记性降低的残基。使用 p < 0.10 的 t 检验确定统计显著性。（b）与CU-MAB（橙色和浅橙色）结合的PD1（绿色）的AlphaFold结构预测，突出显示DEPC CL-MS鉴定的表位和非表位残基。红色球体表示%CL增加的残基，蓝色球体表示%CL降低的残基。
总的来说，这项研究证明了使用 DEPC CL-MS 进行表位图谱的可行性，特别是在研究PD1与溶液中各种抗体的相互作用方面，验证了DEPC CL-MS是治疗性抗体开发中可靠且高效的工具，这对于推进免疫肿瘤学研究至关重要。DEPC CL-MS能提供有关溶剂可及性和微环境变化的详细信息，可用于补充X射线晶体学、AlphaFold预测和HDX-MS结果。但是DEPC CL-MS仍存在一定的局限性，特别是对于没有其他实验结构信息的抗体/抗原复合物，存在结构覆盖限制、潜在的标记丢失和%CL重现性较差等缺点。
文章引用：Mass Spectrometry-Driven Epitope Mapping: Application of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling for the Immunotherapeutic Target Programmed Cell Death Protein
